Способ получения кристаллической гуанил-рибонуклеазы

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских СоциалистическихРеспублик) Дополнительное к авт 2) Заявлено 300574 (21) присоединением заявки 51) М. К 2028420/28 Г 13/1 23) Приорит оедарственный номнтвтСовета Мнннотров СССРпо,делам наобрвтвннйн отнрытнв.15,663 (088.8) 45) Дата ликования описания 15027) Заявител нститут биохим изиоло 4) 1 ОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КРИСТАЛЛИЧЕСКОЙ ГУАНИЛ РИБОНУКЛЕАЗЫотечественного пр е схемы очистки и ыход ц левого продукта.Поставленн-я цель достигается тем, что впредлагаемом способе получения кристаллической гуанил-рибонуклеазы в качестве продуцента фермента используют Язрегд 1 РГиб сРача 1 овР 2654/4, а кристаллизацию осущестнляют диализом против кислого .разбавленного буфера .с последующей фильтрацией кристал" лов, их растворением в буФере и повторной перекристаллизацией путем диализа.Способ осуществляют следующим образом.Гриб ЯьреЯ РРиэ сЬтаВое тв 2654/4 культивируют глубинно на комплексной питательной, среде, из фильтрата кульгуральной жидкости выделяют препарат фермента. Эатем препарат, содержащий фермент, хроматографируют на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой н буфере с нейтральным рН. злее фермент элюируют М аСР в исхо.ном буФере, проводят повторную роматографию в тех же условиях. Элют, содержащий рибонуклеаэу, концентируют высаливанием сульфатом .аммония нли ультрафильтрацией и освобождают от примесей. Фермент кристаллизуют 0 а р Изобретение относится к производству ферментон, в частности кристаллической гуанил-рибонуклеазы, используемой для расщепления рибонуклеиновых кислот белково-нитаминнцх концентратов и в научных исследованиях длярасшифровки структуры РНК.Известен способ получения кристаллической гуанил-рибонуклеазы Т 1, предусматривающий хроматографию преларата, содержащего фермент, злю,ронание фермента, повторную хроматографию,высалинание сульфатом аммония, освобождение от примесей и кристаллизациюфермента 11. 6В качестве продуцента фермента визвестном способе используют препаратпорошкообразной така-диастаэыЯере Д 111 об ог а 1,Выход кристаллов рибонуклеазы ра- Юнен 4,3.Недостатком известного способа является невысокий выход целевого продукта, сложность процесса за счетбольшого количества трудоемких степеней очистки и недостаточная чистотаполучаемой гуанил-рибонуклеазы.Цель изобретения - разработка способа получения гуанил-специфичной рибонуклеазы грибов с использованием ЗО микроорганизмов АН СССР596616 Формула изобретения Составитель А.Бражникова Техред О.Андрейко КоРРектоР С .Гарасиняк Редактор О.Иванова Заказ 1037/29 Тираж 568 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патент, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 при диалиэе против кислого разбавленного буфера, кристаллы Фильтруют и растворяют в буфере с РН 7,5 и затем проводят повторную перекристаллиэацию путем диализа.П Р и м е Р. ГРиб АьрегЯРРПб с 1 ача 1 об Р 2654/4 выращивают глубинно в колбах на качалках при 190 об/мин и 25 С на среде следующего состава (в Ъ): глюкоза - 5,0, пелтон - 1,0, соевая мука - 0,5, МЯХ 04 7 НО - 0,05,Л 2 НО - 0 01 КН(3 - 0 2Продолжительность выращивания при посеве од односуточным инокулюмом 3-4 суток.Иицелий отделяют Фильтрованием, белки нативного раствора концентрируют высаливанием 0,9 насыщенным сульфатом аммония в 50-100 раэ (после осаждения проводят отделение осадка центрифугированием при 5000 ф, растворяют рикаэу в 0,1 И буфере, РН 7,5 и удаля ют нерастворившийся осадок центриФугированием), Затем проводят хроматогра.фию на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в буФере с нейтральным РН, элюцию проводят градиентом НаСЯ в исходном буфере. ц Повторную хроматографию проводят в тех же условиях.:Элюат, содержащий рибонуклеазу, концентрируют с помощью высаливания сульфатом аммония или ультрафильтрацией, затем проводят гель 0 Фильтрацию, на сефадексе (- 50,15 или 100) в буфере слабощелочйого РН.Фермент кристаллизуют при диализе против кислого разбавленного буфера, кристаллы отфильтровывают и растворяют в буфере с РН 7,5, затем перекристаллизовывают при тех же условиях. Предлагаемый способ получения кристаллической гуанил-рибонуклеазы позволяет при использовании отечественного продуцента повысить выход и чистоту целевого продукта, который может быть применен при изучении структуры РНК и белка и механизма действия рибонуклеазы. Способ получения кристаллической гуанил-рибонуклеазы, предусматривающий культивирование ее продуцента на питательной среде, выделение фермента из Фильтрата культуральной жидкости, хроматографию пРепарата, содержащего фермент, элюирование Фермента, повторную хроматографию,.высаливание сульфатом аммония, освобождение от примесей и кристаллизацию фермента, о т л и - ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повьпдения выхода и чистоты целевого продукта, в качестве продуцента фермента используют Авве ндРР 0 э сна а Е О б М 2654/4, а кристаллизацию осуществляют диализом против кислого разбавленного буфера с последующей фильтрацией кристаллов, их растворением в буфере р повторной перекристаллизацией путем диализа. Источники информации, принятые во. внимание при экспертизе:1. М 1 на 1 о Сгуйа И(эа 1 оп ОГ Р (Ьонме 1 еа Т," ,(о она 1 от Восйе е ь 1 у Р 5, 59, 1966, р, 443-448.