Способ получения l-лизин -оксидазы

ОЮЗ СОВЕТСКИХ ОЦИАЛИСТИЧЕСИИРЕСПУБЛИК 1112 Б 1/14 9/О ИЮЮЮ 3 ЗОБРЕТЕНИЯЕТЕПЬСТВУ ПИС ое объеди уоджюте,вене,в 1 КцшпаН.,1980,Е. В.Т. - Во, т, 31 просы мевып. 5,аффинным й СЬ 4 В и Изобретение относится к препаративной энзимологии и касается выделения высокоочищенного фермента и может быть использовано в медицине и научных исследованиях.Цель изобретения - повышени хода целевого продукта и упрощ способа.Способ заключается в следующем.После культивирования Тг 1 сйойегша 11 аккапцш К 1 йа 1 отделяют культу" ральную жидкость центрифугированием осаждают примеси сульфатом аммония (353 насьццения), центрифугируют и проводят хроматографию на гидрофобном сорбенте бутилсилохроме, а затем диализованные фракции Фермента элюиградие м прится фермент м аммотОдо 1 ии проводя е выение олученныи т сульфат омовь пецифиикалы,гидрозинокси тс о ермек ношению ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ СВИ(57) Изобретение относится к препаративной энзимологии и касается выделения высокоочищенного фермента и можетбыть использовано в медицине и научных исследованиях. Целью изобретенияявляется повышение выхода целевогопродукта и упрощение способа. Способ заключается в следующем, Послекультивирования Тг 1 сЬос 1 еггпа 11 авгапцш Кдйа 1 отделяют культуральную жидкость центрифугированием, осаждаютпримеси сульфатом аммония (353 насыщения), центрифугируют и проводятхроматографии на гидрофобном сорбенте бутилсилохроме и аффинном сорбентелизин-сефарозе СЬ 4 В, а полученныйферментный раствор насыщают сульфатомаммония,наносят на колонку бентом лизин-сефаро руют фермент линейн хлористого натрия о5 чем обе хроматограф при рН 5,5-7,4, а п ный раствор насыщаю ния,Использованный бутилсилох сорбент содержит в качестве ческих лигандов бутиловые ра обеспечивающие специфическое Фобное взаимодействие их с л дазои.15Ь-Лизин-сефароза СЬ 4 В отнок биоспецифическому сорбенту4846 50 55 з 145Сорбенты с выбранными структурамиобладают необходимыми свойствами, ко"торые позволяют достичь поставленнуюцель, т.е. освободиться от сопутствующих Ферменту примесей и получитьего с 56,07.-ным выходом,П р и м е р 1. Способ получениявысокоочищенной Ь-лизин- А -оксидазы.Получение сорбента бутилсилохрома 500/80.Получение бутилглицидилового эфира,В колбу вместимостью 1 л, снабженную механической мешалкой, термометром, капельной воронкой и обратным холодильником, вводят 456,8 млн-бутанола и 20 мл ВР (С Н)0. Температуру смеси поднимают до 55 С ипри перемешивании вводят по каплямв течение 4 ч 395 мл эпихлоргидрина.Смесь оставляют на 14 ч, после негопри перемешивании при 20-25 С вводятпо каплям 250 мл 507.-ного раствораНаОН. Выделившийся эфир отделяют,промывают четырьмя порциями дистиллированной воды и продукт высушиваютнад безводным МАМБО. Эфир фильтру;оти перегоняют в вакууме при 57-63 С//19 мм рт. ст,Получение бутилсилохрома 500/80,В колбу вместимостью 500 мл, снабженную механической мешалкой, термометром и обратным холодильником,вносят 100 г силохрома эпоксидного500/80 (ТУ 6-09-10-1618-84), добавляют 350 мл абсолютного диоксана,10 мл бутилглицидилового эфира ипри перемешивании,суспензии вводятпо каплям 7 мл бора трехфтористогоэфирата, Суспензию перемешивают втечение 5-10 мин при комнатной температуре, после чего температуруоподнимают до 90 С и смесь перемешивают 2 ч при 90 С. Полученный сорбент отфильтровывают, промывают диок",саном, этанолом, дистиллированнойводой, ацетоном и высушивают при60-70 оС в течение 24 ч. Концентрацияостатков бутила в сорбенте составляет 80 мкмоль/г.Получение сорбента лизин"сефарозы СЬ 4 В.28 мл сефарозы СЬ 4 В заливают26,4 мл 1 М натриевой щелочи и вводят при перемешивании по каплям втечение 15 мин 5,6 мл эпихлоргидрина.Суспензию перемешивают еще 1 ч прикомнатной температура и 1 ч при 60 С. Затем отмывают 6 раз чередованиемпо 30 мл водой и этанолом, После чегоэноксидированную сефарозу заливаютраствором, полученным следующим образом. 3,1 г хлоргидрата лизина растворяют в 20 мл дистиллированной воды,прибавляют 9,3 г основной углекислоймеди, перемешивают 15 мин при 80 С,оФильтруют и осадок промывают 5 млдистиллированной воды, рН 1 ильтратадоводят до 9,9 добавляют карбонатнатрия до концентрации 1 М. Полученную суспензию перемешивают 4 ч при80 С, фильтруют и осадок промываютопоследовательно 400 мл дистиллированной воды, 500 мл 0,1 М ЭДТА,300 мл воды, 500 мл 0,1 М карбонатом натрия и 400 мл воды,Получение бесклеточной культуральМ.ной жидкости, содержащей Ь"лизин- --оксидазу.Продуцент лизиноксидазы Тгхс 1 поЙегша Ьаггапцш ЫЕа культивируютглубинным способол на питательнойсреде следующего состава г/л: 50пшеничных отрубей и 50 НН 4 Ю, при28 С на качалке в течение 6 сут.оКлетки микроорганизмов и твсрдыеосадки отделяют центрифугированиемпри 3000 об/мин в течение 0,5 ч.В центрифугате определяют удельную1.-лизин-( -оксидазную активность,которая составляет 107 Е/мг белка(1170 мл).Осахдение примесей аммоний сульфатом,В бесклеточную культуральную жидкость в объеме 1170 мл (рН 7,1) судельной активностью 1,28 Е/мг белкапри перемешивании на магнитной мешалке в течение 5 мин добавляют аммоний сульфат марки х.ч. (244,5 г)до 357 насыщения, Перемешивание продолжают еще 1 ч, затем выпавший оса .док центрифугируют при 3000 об/мин втечение 1 ч, Осадок отбрасывают, асупернатант объемом 1250 мл (содер 10 15 20 30 35 40 45 жанне белка 2012 мг, лизиноксидазная активность 2585 ед) наносят на колонку с сорбентом бутилсилохром 500/80.Хроматография ферментного раствора на сорбенте бутилсилохром 500/80.оХроматографию проводят при 4 С. Стеклянную колонку размером 50 х 70 мм заполняют 100 г бутилсилохрома (конц,лиганда 80 мкМ/г), уравновешивают тремя объемами (350 мл) 0,02 М натрий фосфатного буфера (рН 6,6), За46 6обладающего лизиноксидазной Ферментативной активностью, отбрасывают, а последук 1 щий элюат в количестве 72 мл собирают, определяют Ь-лизин- К -оксидазную активность и содержание белка, насыщают до 35 аммоний сульфатом и хранят. Удельная лизиноксидазная активность составляет 27,0 Е/мг, выход по активности на этой стадии хроматографии равен 95%. Общий выход от начальной активности в культуральной среде по примеру 1 составляет 51.8 .П р и м е р 2. Способ получения высокоочищенной-лизин- ( -оксидаэы проводят аналогично примеру 1, только хроматографию Ь-лизин- ( -оксидазы на сорбенте бутилсилохроме проводят при рН 7,4. Полу. чают фермент с выходом 56,0 , с удельной активностью целевого продукта 31,5 Е/мг белка.П р и м е р 3. Способ получения высокоочищенной Ь-лизин-оксидазы проводят аналогично примеру 1, только хроматографию Ь-лизин- К-оксидазы . на сорбенте бутилсилохроме проводят при рН 5,5. Получают фермент с выходом 49,2 , с удельной активностью 26,5 Е/мг белка. 14548 25 Способ получения Ь-лизин- -оксидазы из культуральной жидкости грибаТг 1 сЬойегша Ьагг 1 апцш К 1 йа 1, включающий осаждение примесей Фермента .сульфатом аммония с последующим проведением двухэтапной очистки путемхроматографии с получением целевыхфракций элюата и последующим осаждением последнего сульфатом аммония,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повьппения выхода целевогопродукта и упрощения способа, на первом этапе хроматографию проводят нагидрофобном сорбенте бутилсилохроме,а на втором - ведут аффинную хроматографию на лизин-сефарозе СЬ 4 В и наобоих этапах рН устанавливают 5,57,4, при этом перед проведением аффинной хроматографии осуществляютдополнительную очистку элюата диализом, а осаждение после аффинной хроматографии проводят сульфатом аммония 35% насыщения,50 тем наносят на так подготовленную, колонку с сорбентом со скоростью200 мл/ч с помощью перистальтического насоса 1250 мл ферментного раствора в 1 М аммспий сульФате (35%5насыщения).1(олонку промывают 420 мп 1 М раствора аммопий сульфата в 0,02 М натрий Фосфатпом буфере в течение 7 ч(скорость тока 60 мл/ч), При этомотмываются примеси, которые отбрасы"вают. Затем переключают насос на исходньй 0,02 М натрий Фосфатный буфери элюирование продолжают со скоростью 25 мл/ч. Порцию элюата объемом130 мл, не обладающего ферментативной активносгью, отбрасывают, а последующие Фракции объемом 240 мл собирают, определяют лизиноксидазнуюактивность и белок, которые равны1913 ед. и 218 мг соответственно,что отвечает удельной активности8,77 Е/мг белка, выход по активностина этой стадии 74Диализ,Элюат объемом 240 мл (уд, акт.8,77 Е/мг) диализируют против 0,01 Иуниверсального буфера (УБ), состоящего из равных по объему 0,01 М ук- З 0сусной, борной и ортофосфорной кислот(рН 7,4), при 4 С в течение 20 ч инаносят на Ь-лизин-сефарозу СЬ 4 В,уравновешенную 0,02 М универсальнымбуФером, рН 7,4,Хроматография Ферментного раствора на сорбенте Ь-лизин-сефарозе СЬ 4 В.оХроматографию проводят при 4 С.Стеклянную колонку размером 25 х 140 ммзаполняют 100 мл (25 г сухого вещест-ва) набухшего сорбента Ь-лизин-сефарозы СЬ 4 В, уравновешивают 200 мл0,01 М универсального буфера, рН 6,6.Затем наносят на так подготовленнуюколонку со скоростью 24 мл/ч 240 мл 4диализата (210 мг белка, 2034 ед.лизиноксидазной активности). Исходным буфером (тот ые уравновешивающий)объемом 420 мл со скоростью 24 мл/чвьмывагт примеси и отбрасывают. Затем исходный буфер заменяют на градиент равных по объему(исходный бу;,Фер - 1 М раствор натрия хлористого)и элюирование продолжают с той жескоростью. Порцию 120 мл элюата, не55. Формула изобретения