Способ определения активности транскетолазы

гО Й- И-СА. Н,И Е ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Сееетеких Социалистических Республик(45) Дата опубликования описания 1909,78(51) М. Кл. б 01 М 31/14 Государственный комитетСовета Министров СССРно делам и юбретенийи открытий(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ТРАНСКЕТОЛАЗЫ10 25 Изобретение относится к методам исследований, а именно к определению активности ферментов в билогических субстратах, в частности сперме хряков.Известен способ определения активности транскетолазы в сыворотке крови по Ф.Брунса, основанный на образовании седогептулозо-фосфата (11,В инкубационной среде, состоящей из 0,5 мл 0,1 М трис. НСЙ буфера и 0,01 М раствора рибозо-фосфата (рН 7,6) добавляют 1 мл сыворотки крови и инкубируют при 37 С в течение 2-4 час. Конечный объем инкубационной смеси 1,5 мл. Прекращают реакцию добавлением 1,5 мл 10-ной трихлоруксусной кислоты. В трихлоруксусном фильтрате определяют гептулозу, по количеству которой судят об активности транскетолазы, для чего к 1 мл фильтрата добавляют 0,2 мл концентрированной НС 1 в пробирках с притертой пробкой, подогревают в кипящей водяной бане в течение 80 мин После охлаждения к смеси добавляют 0,2 мл РаствоРа Рвсаз ( 13 мг ГеСЕа в 100 мл 2 н НС 1) и 0,075 мл 6-ного раствора орцина в метиловом спирте. Тщательно перемешивают и повторно подогревают в течение 3 мин в кипящей бане. После охлаждения добавляют1,475 мл этилового спирта, образуется синее окрашиванне при максимальномпоглощении 625 мкм.Определение активности транскетолазы этим мотодом требует использования метилового спирта, который является особо токсичным, кроме того, для.приготовления стандарта гептулозыне всегда имеется в наличии этот сахар.Этот метод недостаточно точный,так как часть гептулозо-Фосфатапод влиянием Фермента трансальдолазыпревращается в фруктозо-Фосфат изритрозо-фосфат, что ведет к потерегептулозофосфата.Целью изобретения является повьыение точности анализа,Это достигается тем, что перед добавлением исследуемого материала в реакционную смесь вносят гидразинсульфат для связывания фосфотрноз и ингибирования трансальдолазы и хлористый магния для активирования транскетолазы.Способ осуществляют следующим образом.629500 Формула изобретения Составитель А.МакаровТехред З.фанта КорректорЛ.Веселовская Редактор Д.Пинчук Эакаэ 6062/40 Тираж 1112 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушскдя наб д.4/5филиал ППП Патентф, г.ужгород, ул, Проектная, 4 К инкубационной среде, состоящей иэ раствора трис, НС 2 буфера (рН,6) 0,1 М - 0,5 мл,гидразинсульфата 0,16 М,25 мл, хлористого магния 0,1 М - 0,02 мл натриевой соли рибозо-фосфата 0,03 М - 0,25 мл добавляют исследуемый материал в количестве 1 мл 1 инкубирхют в водяной бане при 37 С в течение 2 час. В контрольные пробы перед добавлением исследуемого материала вносят 2 мп 10-ной трихлоруксусной кислоты, в опытные пробы кислоту вносят после инкубации. Через 30 мин пробы фильтруют.При определении активности транскетолаэы.по образованию Фосфотриоз к 1 мл фильтрата добавляют 1 мл 0,75 н. раствора МаОН, оставляют на 10 мин при комнатной температуре, добавляют 1 мл 2,4-динитрофенилгидразина и подогревают на водяной бане при 38 С в течение 10 мин. Доводят объем про-. бы 0,75 н. раствором йаОН до 6 и 8 мп и колориметрируют при 540 ммк (зеленый светофильтр). Стабильная окраска сохраняется на протяжении 15 мин.Активность транскетолазы в сперме хряка можно определять и по приросту гептулозы или по убыли в инкубационной среде пентоз,В центрифужные пробирки к 0,5 1,0 мл трихлоруксусного фильтрата добавляют равный объем орцинового реактива (1%-ный раствор орцина,приготовленного на 0,1%-ном растворе хлорного железа) в концентрированной соляной кислоте НСЙ. Закрывают.воздушными холодильниками и кипятят в водяной бане 40 мин, После охлаждения разбавляют дистиллированной водой до 6 мл и центрируют на протяжении 10 мин при 4000 об/мин. Аккуратно сливают на достаточную жидкость и в ней определяют концентрацию пентоз. .при 660 ммк. Осадок растворяют в 3 мл или больше этилового спирта. Появляется сине-зеленый цвет с максимальнымпоглощением 640 ммк, В обоих случаяхстабильная окраска сохраняется продолжительное время. Имея стандартныйраствор гептулозы или рибозы по про порции или калибровочному графику,можно высчитать количество убыли пентоэ или прирост гептулозы,по которымможно судить об активности транскетолаэы.1 О При отсутствии химических чистыхфосфотриоз можно испольэовать щелочно-лабильный фосфат из фосфотриоз,образовавшихся в ходе форментативнойреакции.)6 Применение предложенного способапозволит с большой точностью определить активность транскетолаэы безприменения метилового спирта. Способ определения активноститранскетолазы,преимущественно в спер,ме хряков, включающий введение иссле,дуемого материала в реакционную смесь,содержащую трис. НСЙ буфер, натриевую соль, рибозо-фосфат с последующим инкубированием, добавление раствора трихлоруксусной кислоты для прекращения реакции и определение активности по количеству образовавшихсяФосфотриоз или гептулоэ или по убылипентоз, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения точности анализа, перед добавлением исследуемого.35 материала в реакционную смесь вносятгидразинсульфат в виде 0,16 М раствора в количестве 0,25 мл и хлористый магний в виде 0,1 М раствора вколичестве 0,02 мл.40 Источники информации, принятыево внимание при экспертизе:1.Вгцпз Г.,В 1 осЬещ,ейзсйгЖ 330,1958, Ь,497,