Способ иммобилизации кислых протеиназ

Союз Советскии Свциалистическии РеспубликОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКОМУ СВИ) Дополнитель к авт. свид.в ЗаовлЕно 15,07,76(21) 2385116/2 Ес присоединением заявки Госудерстееиивб иемитвт йввта Мииистрев СМ ае делам иаеервтвии и еткрытий) Дата опубликования описания 22,07 А. А. Чуйк К. Антонов В, А. Тертых . Козлов и В ЯнишпольскийКрыпова, Л.) Авторы изобретеии Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякин и институт физической химии им. Л, В, Писаржевско 1) Заявител 54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ КИСЛЫХ ПРОТЕИНАЗения фен Изобретение относится к способу попучения иммобипизованных препаратов ферментов, а именно к способу попуч иммобилизованных киспых протеиназ, которые могут найти широкое применение в пищевой, химической, микробиопогической промышленности, а также в лабораторной и медицинской практике, Сорбентами, проходящими дпя этих целей, могут быть кремнеземсодержаыие материалы, инертные в реакционных средах и разрешенные к применению в соответствующих отраслях промышленности (пищевой, медицинской).В литературе описано бопьшое число способов иммобилизации ферментов на кремнеземсодержаших носителях, В частности, для иммобинизации киспых протеиназ используют сипохром, активированный хлористым циануромЦ. Однако в таком способе активность чаемых препаратов низкая, а связь мента с носителем недостаточно прочпоскольку образующаяся связь-5 - О - С - легко подвержена гидролизу.Известен также способ иммобипизацикислых протеиназ на стекпе и силохроме, модифицированных аминооргсипаном,который осуществляют с помощью агента, сшиваюшего бепок и носитель, растворимого карбодиимида,Однако в этом способе активностьполучаемых препаратов низкая. Крометого, водорастворимый карбодиимид является дорогостоящим и маподоступнымреактивом,С целью повышения прочности связиферментов с носитенем и увеличенияудельной активности препаратов предпагается способ иммобилизации кислыхпротеиназ, который осуществляют иакремнеэемсодержаших носителях, модифицированных аминооргсипаном, предварительно активированных хлористымци 1 нуром, и заключающийся в том, чтоферменты вводят во взаимодействие сносителем, предварительно активированным хлористым циануром.621680 35 Составитель А. БочароваРедактор В. Мирэаджвнова Техред М. Борисова Корректор А. Гриценко Заказ 5019/9 Тираж 559 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по депвм изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Ра; шская нвб., д. 4/5филиал ППП фПатент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Препараты иммобипизованных кислыхпротеиназ, полученные предложеннымспособом, более чем в 10 раэ превосходят по активности препараты, полученные известным способом.Процесс проводит следующим обра:зом,Иммобиизация кислых протеиназ происходит в две стадии. На первой стадиикремнеземсодержащий материал, модифицированный аминооргсиланом, активируют10путем его обработки хпористым циануром,На второй стадии ферменты вводят в контакт с активированным носителем, приэтом ферменты связываются с носителем15кова пентно.Предложенный способ может быть использован дпя иммобилизации многихферментов и белков. Кроме того, целевая иммобипиэация кислых протеиназ20интересна тем, что эти ферменты неустойчивы при нейтральных и щелочных значениях рН и теряют активность в усповияхбольшинства методов иммобилизации.П р и м е р,Активация аминоаэросипахг ристым циануром.Аминоаэросип (1 г) добавляют в 5%иый раствор хлористого цианура в смесидиоксан-тонуоп (15 мп, 4:1, по объему),смесь перемешивают нв магнитной мешалЗОке 30 мин, активированный носитепь промывают смесью диоксан-топуоп (4:4, пообъему, 3 Х 50 мп) и диоксвном (100 мп)Продукт высушивают в вакууме при комнатной температуре,Активация аминосилохромв хлористымциануром.Аминосипохром (3 г) активируют аналогично аминоаэросипу, испопьзуя 20 мп5%-ного раствора хпористого цианура в40той же смеси растворителей.Иммобигиэация пепсина на активированном хлористым циануром: аминоорганоаэросипе.Активированный хлористым циануром45вминоорганоаэросил (1, г) .вносятв расзвор (27 мп) пепсича (460 мг) в 0,1 Мацетатном буфере (рН 4,5), перемешивают 1 ч при комнатной температуреи 18 ч при 4 С. Иммобипизованный феромент отделяют от несвязанного ферментапутем промывания препарата 1 М воднымраствором хлористого натрия до исчезновения светопогпощения при 280 нм впромывных водах и 0,1 М ацетатнымбуфером (рН 4,5) до отсутствия ионовхлора. Активность полученногопрепаратаиммобилизованного пепсина по гемогпобину составляет 155000 ед./г сухогопрепарата. Препарат хранят в О, 1 Мацетатном буфере, рН 4,5,Иммобипизация пепсина на активированном хлористым циануром аминоорганоси лохроме.Активированный хлористым циануромаминоорганосилохром (1 г) вносят враствор (7,5 мп) пепсина (46 мг) в0,1 М ацетатном буфере (рН 4,5), затемпроводят иммобипиэацию аналогично описанному дпя аминоорганоаэросипа. Активность полученного препарата иммобипизованного пепсином по гемогпобину составляет 51000 ед./г сухого препарата, Препарат хранят в О, 1 М ацетатном буферерН 4,5,формула изобретения Способ иммобилизации кислых протеинаэ нв кремнеэемсодержащих носителях,модифицированных аминооргсипвном, о та и ч а ю щ и й с я тем, что, с цепьюповышения прочности связи ферментов сносителем и увеличения удельной активности препаратов, киспые протеиназы вводят во взаимодействие с носитепем, предввритепьно активированным хпористымциануром.Источники информации, принятые вовнимание при экспертизе;1, Крылова К), И, Коэпов Л. В., Антонов В. К., Гаина Б, СОвтунашвили Е, Н.Павленко Н. М. Иммобипизация киспыхйпротеинвэ. - Биоорганическая химияф,1976, 2, с, 273,