Способ иммобилизации ферментов

ОП ИСАЙ ИЕ ИЗОЕЕЕтЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ц 770072 Союз Советских Социалистических Республик(51) М Кл з С 07 6 7/02 с присоединением заявки -Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(43) Опубликовано 07.01.82, Бюллетень1 (45) Дата опубликования описания 07.01.82(54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦ ЕРМЕНТО Изобретение относится к мивробиологической промышленноспи, а именно к технике получения ферментов, ковалентно связанных с носителем,Известен способ иммобилизации ферментов,. включающий обработку модифицированного 1-аминопроаилтриэтоконаиланом крвмнеземсодержащего нооителя сшивающим агентом и связывание фермента с полученным носителем 11. В качестве ащивающето агента используют диальдепиды, на. пример глутаровый или малоновый диальдепид, обычно в виде 25% нного раствора.Связывание ферментов с обработанным носителем ведут известными способами,в инертной (обычно водной) среде, при температуре и рН, не вызывающих внактнвацни фермента.Однако глутаровый диальдегид, используемый в известном способе в качестве сшивающего агента, кори хранении изменяет свои свойства, быстро лолимеризуясь на свету,и цри действии вещеспв основного характера; в процессе реавиии тлутаровый диальдегид лолимеризуется на поверхности аминоюремнезема, образуя дродукты неустановленного строения, что с одной стороны затрудняет контроль эроцеоса модификации носителя и вммобилизацни фермента, а с другой стороны, ориаодит.к снижению активности полученных иммобилнзованных препаратов за счет уменьшения числа актнвных функциональных групп на поверхности носителя; активность получен ных иммобилизованных ферментов колеблется в широюих пределах в зависимости от степени очистки и срока хранения глутарового диальдегида.Целью, изобретения является повышенне 1 О активности иммобилизованных ферментов,улучщение их качества, т, е. достижение стандартности получаемых лрепаратов.Указанная цель дост 1 игается тем, что вкачестве сшввающспо агента используют 1 Ь ацетали диальдегидов, а обработку иминосителя осуществляют в врисутствии кис.лоты. Причем в качестве юремнеземсодержащего носителя обычно используют силохром, пористое стекло или аиликатель, в 20 качестве ацеталей диальдегидов - тетраметил-, тетраэтил-, тепрабутилацетали глутарового или малоновозо диальдепида; причем ацетали используют обычно в виде 1 - 10%-иых растворов.Ж В отличие от исходных кар бонильныхсоединений ацетали более устойчнвы к действию щелочных и окнсляющих агентов.Также как и исходные альдепиды ацетали легко реагируют с азотистыми основания- ЗО ми, папример с аминами. Этн свойства аце77 О 072 общей активностью 200 ед в 0,1,н ацетатном буфере (рН 4,7). Реакционную смесь перемешивают нри 25 С в течение 5 ч, после чего иммобилизованный препарат промы вают 1 л 1 о/о-ного РаствоРа Растворимогокрахмала для удаления химически,несвязанного фермента, затем 1 л 0,1 н ацетатного буфера (рН 4,7) и 1 л воды. Акпивность иммобилизованной глюкоакилазы 10 74,8 ед/г (онределяют по глюкозооксидазной методике на приборе фирмы Бекман), количество связанного белка 18,7 м;г/г. Аналовично,примеру 1 проводят нммобилизацию глюкоамилазы на пори стои стекле МПСи аиликагеле МСА 750. Полученные данные приведены в табл. 1. Таблица 1 Иммобилизация глюкоамилазы из Азр, п 1 дег на различных носителях, обработанных тетраметилацеталем малонового альдегидаСодержаниемг экв/г Носитель Пористое стекло МПС1 порисотость 1,2 смз/г, пор 1100 А) 0,36 20,4 96,1 Спликагель МСА(пористостьо0,37 смз/г, пор 750 А) 0,4 8,3 64,3 П р и м е р,2, Иммобилизация глюкоамилазы 1 из Аэр, п 1 дег с 1 помощью тетраэтилацеталя глутарового альдепида. 20 Таблица 2 Иммобилизация глюкоамилазы из Азр. п 1 дег на различных носителях, обработанных тетраэтилацеталем глутарового диальдегидаСодержание мг экв/г Носитель Пористое стекло МПС1 порисотость 1,2 смз/г, пор 1100 А) 85,6 12,6 0,36 Спликагель МСА(пористость0,37 см%, пор 750 А) 0,4П р и м е р 3, Иммобидизация кислойпротеиназы с,помощью тепрабупилацеталя 30глутарового диальдегида. талей позволяют успешно проводить,иммобилизацию ферментов, достигать стандартных результатов с лолучением высокоактивных иммобилизованных ферментов,П р и м е р 1. Иммобилизация глюкаамилазы из Азр. п 1 дег с промощью тетраметилацеталя малонового,диальдвгида.К 1 г силохрома С, обработанного у-аминопропилприэтоксиаиланом н содержащему 0,6 мт экв аминопрупл на 1 г, прибавляют 10,мл 2%-иого 1 раствора тетраметилацетагля малонового диальдегида в 50%-ном водном этаноле,и 1 мл ионцентрированной соляной кислоты, переиешввают 2 чпромывают спиртом, водой, К актин 1 ированному ноаителю прибавляют 10 мл распвора глюкоамилазы вз Азр. п 1 дег с К 1 т аилохрома С, обработанного тепраэтилацеталем глутарового диальдегида согласно примеру 1, прибавляют 10 мл раствора глюкоамилазы,из Азр, п 1 дег с общей активностью 200 ед:в 0,1 н ацетатном буфере (рН 4,7). Реакционную смесь перемешивают в течение 5 ч при 25 С,после чего иммобил)изованный пренарат промывают 1 л субстрата (1%-ный раствор ,растворимого,крахмала), 1 л О,1 н ацетатного буфера (рН 4,7) и затем 1 л волы. Активность иммобилизованной глюкоамилазы 72 ед/гколичество связанного белка 10,1 мт/г, Аналогично лр 1 кмеру 2 проводят иммобилизацию глюкоамилазы на пористом стекле МПСи оиликагеле МСА, Полученные данные приведены в табл. 2,. 64,3 8,3К 1 г силохрома С, обработанного тетрабутилацеталем глутарового диальдегида согласно примеру 1, приливают расКо пясство связанного белка мг/г1-1 осптель 11.6 0,36 45,6 7,8 42,3 0,4 твор ферментного препарата (лротоавамо,рин Г 25 х) с общей активностью 132 едПС и содержа 1 нием белка 120 мг в 0,1 М универсальном буфере (рН 4,1). Реакционную смесь инкубируют в течение 3 ч при 5 С и перемешивалии, По окончанни реакции иммобил 1 изованный;препарат отмывают на фильтре 1 л воды, 1 М раствором хлористого натрия,и опять водой до полного отсутствия белка в промьгвных водах, Активяость иммобилизованной кислой протеиназы 132 едПС/1 т, содержание белка 30 мт/г. (Протеолитическую активность нативного и иммобилизованного препаратов,кислой протеиназы определяют по казеинату натрия модифиц,ирован,ным методом Ансона).Аналогично описанию примера 3 проведена иммобилизация ки 1 слай протеиназы:на оилохроме Сс помощью тетраметилацеталя малонового диальдепида. Активность иммобилизованной кислой протемназы 144 ед/г, .количество связанного белка 30 мг/г.Пр,и м ер 4. Иммобилизация нейтральной протеиназы с помощью тетраметилацеталя малонового диальдегида.К 1 г оилолрома С, обработанному тетраметилацеталем малонового диальдегида согласно примеру 1, приливают раствор нейтр алиной протеиназы (п 1 ротосубтилнн ГЗх) с,общей акт 1 ивностью 110 едПС,и содержанием белка 50 мг в 0,1 М универсальном буфере (рН 7,0): Реакционную смесь инкубируют в течение 3 ч при 5 С и непрерывном перемешивавии. По окончании;реакции иммобилизованный п 1 репарат отмывают 1 л воды, 1,0 М раствором хлористого,натрия и опять водой до полного отсутствия белка в промычавных водах. Активность,иммобилизованиой нейтральной протеиназы 14,3 едПС/г, содержание белка 14,0 иг/г.Аналогично иримеру 4 проводят,иммобилизацию нейтральной протеиназы с помощью тетраэтилацеталя глутарового диальдегида. Активность иммобилизованной нейтральной протеиназы 6,0 едПС/г, количество связанного белка 9,5 мг/г. Пористое стекло Мг 1 С1 порпстость 1,2 с.,Р/г, пор 100 Л) Спликагсль ЧСЛ.760 (порпстость о 0,37 смз/г, пор 750 Л)П р и и е р 5. Иммобилизация инвертазыс помощью тетраэтилацеталя глутарового диальдегида.К 1 г аилохрома С, обработанноготетраэтилацеталем;глутаровото диальдегида сотласно примеру 1, прибавляют 10 .мл раствора дрожжевой,инвертазы с общей активностью 2000 ед в 0,1 М ацетатном буфере (рН 4,7). Реакционную смесь переме шивают в течение 6 ч прои 25 С, после чегоиммобилизованный преларат промывают 1 л 1 М 1 раствора хлористого, натрия 1 и затем 1 л воды. Активность,иммобилизованной кнвертазы 1050 ед/г, количество овязанно 1 го б белка 12 мг/г. (Активность нативного и иммобнлизованнаго првпаратов кнвертазы определяют глюкозооксидазным методом,на .приборе фирмы Бекман).П;р и м е р 6. (Контроль) Иммобилиза ция глюкоамилазы 1 из Азр. п 1 еег с помощью тлутарового диальдепида.К 1 г силохрома С, обработанного уаминолропилтриэтоксисиланом и содержащего 0,6 мг экв аминогрупп на 1 т носи теля, прибавляют 2%-ный распвор глута;рового диальдегида фирмы Реанал в 0,5 М фасфатном буфере (рН 7,0) и неремешивают при 25 С в течение 1 ч, затем нооитель промывают 2 л воды для удале ния непрореагировавшего глутарового диальдегида и к носителю приливают 10 мл растзо 1 ра глюкоамилазы из Аэр, п 1 дег 1 в 0,1 М ацетатном буфере (рН 4,7) с общей активностью 200 ед. Реакцию связывания 36 глюкоамилазы с носнтелвм продолжают втечение 3 ч при 25 С при постоянном перемешивании, по окончании реакции иммобилизованный фермент промывают 1 л 1%- наго раствора растворимото крахмала для 40 удаления нековалентно связанного белка,1 л 0,1 М ацетатного буфера (рН 4,7) и 1 л воды. Активность иммобил 1 изованного препарата 40,4 ед/г, количество связанного белка 9,3 мт/г.46 Аналопично примеру 6 проведена пммобилизация глюкоаиилазы на пористом стекле МПСи силпкагеле МСА, Полученные данные представлены в табл, 3.770072 Формула изобретения Составитель О, СкородумоваТехред И. Заболотнова Корректор И. Осиновская Редактор П. Горькова Заказ 28/38 Изд.108 Тираж 389 Подпи"иоеНПО Поиск Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Тип. Харьк, фил. пред. Патент П ри мер 7 (контроль), Им 1 мобилизация нейтральной протеиназы с помощью глутарового диальдегида.К 1 г оилохрома С, обработанному у-аиинопропилтриэтоксисиланом и содержащему 0,6 мт экв аминогрупп на 1 т носителя прибавляют 2%иный раствор глутарового диальдепида согласно примеру 6, прибавляют раствор, нейтральной,протевназы с общей активностью 110 ед и содержанием белка 50 мг в 0,1 М универсальном буфере рН 7,0. Дальнейшую обработку проводят согласно примеру 4. Получают препарат иммобилизоваяной аротеиназы с активностью 3 едПС/г и содержанием связанного белка 6,0 мг/т.П р и м е р 8. (Контроль), Иммобилизация кислой протелназы с помощью глутарового диальдегнда.К 1,г оилохрома Сс содержанием аминогрупп 0,6 мг экв/г, обработанного 2%-ным раствором глутарового диальдегида согласно примеру 6, прибавляют раствор,кислой протеиназы с,общей активностью 132 ед и содержанием белка 120 мг в 0,1 М универсальном буфере (рН 41). Дальнейшую обработку проводят согласно примеру 3. Активность,полученного препарата иммобилизованной кислой протеиназы 29 едПС/г,;количество связаниого белка 32 мг/г. Пр и м е,р 9 (контроль). Иммобилизащия дрожжевой инвертазы с помощью глутарового диальдегщда.К 1 г силохрома С, обработанного 2%-ным раствором глутарового альдепида согласно иримеру 6, прибавляют 10 мл 1 раствора инвертазы с общей активностью 2000 ед в 0,1 М ацетатном буфере (рН 6,5), Реакцию связывания;инвертазы с носителем продолжают 6 ч при 25 С при перемешивании. По окончании реакции иммобилизованный фермент промывают 1 л 1 М раствора хлористого натрия для удаления нековаленпно связанного фермента,и 1 л воды. Активность иммобилизованнопо препарата 760 ед/г, количество связанного бел ка 9,8 мт/г.Таким образом описываемый опособ иммобилизации ферментов с помощью ацета лей диальдепидов дает возможность получать препараты иммобилизованных ферментов, активность,которых вьипе, чем активность ферментов, иммобилизованных с помощью диальдепидовнапример глутаро вого диальдетида (например для глюкоамилазы,в случае оилохрома Сактивность выше на 46%, пористого стекла МПС 1100 - 53%, силикагеля МСА- ,на 39%).Кроие того при нммобилизации с помо щью ацеталей диальдепидов получаютстандартные по активности препараты. 1. Способ иммобилизации ферментов пу тем обработки модифицированного у-аминоцропилтриэтоксисиланом кремнеземоодержащего;носителя сшивающим реатентом с последующим связьгванием фермен 25 та, отл и ч а ю щ ий с я тем, что, с цельюповышения активности и улучшения качества целевого продукта, в качестве сшивающего агента используют ацетали диальдегидов, а обработку,ими носителя осу 30 ществляют в присутствии ивслоты.2, Способ по,п, 1, отличающийсятем, что в качестве креынеземсодержащегоносителя используют силомером, или пористое стекло,или оиликапель.35 3, Способ по л, 1, отл ич а ю щи йсятем, что ацетали диальдепидов используютв виде 1 - 10%-ных раствора,4, Способ по пп, 1 к 2, о т л и ч а ю щи йс я тем, что в,качестве ацеталей диальдепи 40 дов используют тетраметил-, тепраэтил-,тетуабутилацетали глутарового или малонового диальдегида. Источник иноформации, принятый во:45 внимание при экспертизе: 1. Патент США3669841, кл. 195-63 апублик. 1972 (прототип),