Способ выделения и очистки кислой протеиназы из растворов

Союз Советских Социалистицескчх Республик(23) Приоритет Госудаостаенный квинтет Совета Министров СССР га делам нзооратеннй н откротий(54) СПОС В ВЬДЕ.1 ГНИЯ И ОЧИСТКИИЗ РАСТВОРОВ ОЙ ПРОТЕИНАЗЫ дия объ хо вылаглас- сорбе та ликви и этих не качествей (отечес сп но предлагаем О та используют ный) гель - со ванный на осн ющий формулутвенанионообменнь бент в СГ ф ве поливинило орме, си вого спи езироз, иместадиях мент об-СН. - СН.-М -СН-СН-С г г г ОН О О 11 Ж гМР 1Ы 1 н-ОИ40 н -0 Н 2 Нг Н-М Изобретение относится к ферментной отрасли мик робиологической промышленности; а именно к способам выделения и очистки кислой протеиназы из растворов,Известен способ выделения и очистки кислой протеиназы из растворов, например культуральной жидкости гриба АерегрЯСое ааотттои 1, предусматривающий сорбцию фермента на ионообменнсм ссрбенте с последующей десорбцией его элюентом г 11 При работе по из:естному способу имеют место большие потери фермента на очистки (до 90%). Лолу.аемый фер падает недостаточной активностью, пр из-за больших потерь фермента на ста очистки работа связана с увеличением исходного материала и большоорганического растворителя, чтсебестоимость фермента,538018 3и обладающий сорбционной емкостью 0,5- 0,8 мг.экв/г, набухаемостью не менее 20- 25 мг/г, при этом процесс сорбции осуществляют при рН 4,0 - 5,0, а процесс десорбции проводят 10 У-ным раствором поваренной соли при рН 7,0-8,0.Для перевода анионообменной смолы (АГС 1 п) в С 1 -форму ее подвергают набуханию в воде, затем отфильтровывают и обрабатывают 30-60 мин 5%-ным раствором соляной 10 кислоты в количестве 3-5 об, на 1 об. набухшей смолы, После фильтрации смолу отмывают дистиллированной водой до рН 6,0- 7,0, Расход воды при этом составляет 10- 15 об, на 1 об, смолы. 1 б Использование смолы АГСп в С 1-"форме с ионообменной емкостью 0,5-0,8 мг. экв/г и набухаемостью 20-25 мл/г обеспечивает 90-94% сорбции кислой протеина- р зы и 86-90% десорбции фермента, Элюент берут в количестве 8-10% к объему обрабатываемой исходной культуральной жидкости,В результате такой обработки достигается десятикратное концентрирование кислой 25 протеиназы и в 5 раз повышается степень очистки Фермента, Из элюента фермент выделяют одним из известных способов, например осаждением органическими растворителями. 30Препарат кислой протеиназы, полученный по предлагаемому способу, имеет активность, определенную стандартным методом (модифицированный метод Ансона с казеинатом натрия) ПА 200-250 ед/г по активности 3 он в 1000-1500 раз выше, чем активность его в исходной культуральной жидкости.П р и м е р 1. Концентрирование и очистку кислой протеиназы проводили из фильтрата культуральной жидкосТи Аьр ажО щог 1 78-2. Процесс сорбции вели в динамических условиях в колонке высотой 30 см и диаметром 3, 5 см. Анионообменный гель- сорбент АГСп в количестве 5 г замачивали и отмывали дистиллированной водой, 45 после чего ионообменник переносили в колонку, Подготовленный таким образом ионообменник занимал 2/3 объема колонки, Обработку проводили 5% ным раствором НС 1, для чего через колонку пропускали 600 - 50 700 мл этого раствора с последующей отмывкой 1,5 - 2,0 л дистиллиоованной воды. Затем через колонку пропускали фильтрат культу- ральной жидкости с активностью 0,15 ед/мл и рН 4,6, Процесс сорбции вели со скорос- б 5 тью 500 мл/час до появления в фильтрате фермента 5-10% протеолитической активности от исходной (в расчете на 1 мл), Через колонку было пропущено 830 мл фильтрата культуральной жидкости. бО Сорбционная емкость смолы АГСп покислой протеиназе составила 25 ед/г смолы.В этих условиях на смоле было сорбировано94% фермента от содержавшегося в фильтрате культуральной жидкости.Десорбцию фермента проводили 10%-нымраствором МаС 1 с рН 7,5. Расход элюента составил 85 мл, скорость его 150120 мл/час, Десорбция прощла на 90%, удельная активность фермента в элюате в 5 развыше, чем активность в фильтрате культуральной жидкости. Из полученного элюатапосле предварительной корректировки рН до4,5 - 5,0 фермент осаждали этанолом в соотношении элюата и этанола 1:4, Осадок отделяли на центрифуге и высушивали лиофильно.П р и м е р 2, Концентрирование и очистку кислой протеиназы проводили из фильтрата культуральной жидкости гриба АС. цаатпог16, Процесс сорбции веди в динамических условиях в колонке высотой 150 см идиаметром 16 см. В колонку загружали250 г (анионообменного гель-сорбента АГС 1 п) по сухому весу после предварительнойего обработки и перевода в С 1 -форму, Через колонку со скоростью 10 л/час пропускали 80 л фильтрата культуральной жидкости Аьр ащатпо 1 16 с активностью кислойпротеиназы 0,2 ед/мл и рН 4,15. Сорбцияфермента в этих условиях прошла на 94%,Десорбцию кислой лротеиназы проводили107 о-ным раствором КаСФ при рН 7,0.Элюат в количестве 8 л пропускали черезколонку со скоростью 1,2-1,5 л/час. Десорбция фермента прошла на 86%, Активностьфермента в элюате в 8,5 раз выше чем/активность фильтрата культуральной жидкости, Удельная активность фермента была повышена в 5-7 раз, Фермент из элюата срН 4,5 осаждали этанолом, осадок отделялицентрифугированием и высушивали лиофильно, Высокоочищенный препарат кислой протеиназы Протаваморрин Г 25 Х, полученныйпо предлагаемому способу, имел активностьдо 230 ед/г. Содержание белка в препарате 45-50%,Таким образом, применение смолыАГСппо предлагаемому способу позволяет одновременно концентрировать и очищать кислую протеиназу непосредственно из фильтрата культуральной жидкости. Достигнутая десятикратная степень концентрирования фермента в 10 раз сокращает расход органических растворителей, применяемых для выделения фермента, и значительно сокращаетемкостное оборудование, используемое дляего производства, При этом в 5 раз повышается степень чистоты получаемого препарата.его эпюентом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода и активности фермента, снижения его себестоимости, в качестве сорбента используют анионообменный гель-сорбент в С 1 -форме, синтезированный на основе поливинилового спирта, имеющий формулуСН-СН Источники информации, мание при экспертизе:1, Авторское свидетельство М кп,С 12 3 13/10, 1969 г,принять во вни 29,Составитель М. АндрееваРедактор Л, Ушакова Техред О. Луговая Корректор д, 3 орЗаказ 5670 Л 5 Тираж 555 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская набд, 4/5 ина Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,Способ выделения и очистки кислой протеиназы из растворов, например культуральной жидкости гриба А 5 регц Ииз аикииог,пре дусматривающий сорбцию фермента на ионообменном сорбенте с последующей десорбци 0,5 И нее 20- осушест- циив и обладающий сорбционной емкостью 0,8 мг,экв/г и набухаемостью не м 25 мл/г, при этом процесс сорбции вляют при рН 4-5, а процесс десор при рН 7-8,СН - СН 2ОСН