Способ получения n ацетилглюкозаминидазы bacillus suвтilis вкпм в-2471

СОК)Э СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИК А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 2замцнидазы, Способ заключ денци биомассы Вас 111 цз в Вацетоном в соотнош делении ее центрисЬугирова пендцровании в буфере.,Да. зию биомассы обрабатывают ется в осажЬС 111 в ВКПМнцц 1:1 отее суспен- препаратом ысокоочц глюкозамиК тому елсния це- обработке имическимфии на хиэтапы центции и ион-лы,изосомальных б ри диагностике Изобрете ществ, при лечении л лезней, как эталон п раковых заболеванийЦель изобретения хода целевого продук способа получения ба ацетилглюкозаминидаз относится к бцотехносастности к техн логии полуьного фер- тилглюкоза,соги чени очишенного бактерцал ого препарата-Н-аце азы, которыц можно ис сследованци карбогидр липидных ц глцкопроте увеличение выта и упрощение ктериальной /-Ян пользоватьазной части ри ли цновых ве ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Всесоюзный научно в исследовательский институт прикладной энзимологии (72) В.Д.Паюодис, П.Л.Валанчюс и В.Б.Авсссенис(56) Авторское свидетельство СССР Р 622282, кл . С 12 11 9/00, 1/20, 1976Ог 1 к,1.М, еТ а 1. В 1 ос 1 сеш 1 са еТ Вдорйузсса Аса 1972, ч. 289,. р. 1 74 - 186.(57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения очищенного бактериального ферментного препарата, 1 з-М-ацетилглюкозаминидазы, который можно использовать при исследовании карбогидразной части гликолипидных и гликопротеиновых веществ, при лечении лизосомальных болезней, как эталон при диагностике раковых заболеваний. Цель изобретения - увеличение выхода целевого продукта и упрощение способа получения бактериальной ф-М-ацетилглюко 801671691 А 1-"-ацетцлглюкозаминидазы до перевода экзо-Р-И-ацетилглюкозаминцдазы в растворимое состояние, потом гелем фосфата кальция, для образования которого вносят 8 об.Е хлористого кальция, затем сЬильтруют в присутствци 8 об. фильтроперлцта. Полученныц фильтрат обессолцвают диафильтрацией, фермент очищают хроматографией на депротеинизированном хитине, где сорбцию фермента проводят при рН 3,5 - 4,0, а элюцию - при рН 4 - 1 Ч. При использованиц данного способа выходщенного препарата (3 -11-ацетнидазы повышается в 10 разже упрощается способ выдлевого продукта благодарябиомассы ферментативным, хпутем и афинной хроматогратине. При этом исключаютсярифугирования, гель-фильтрной хроматографии. 2 з.п,2 табл, 671691Сцс)б эд е;)дотя ц д "сс)юц)биомассы Вдс 11 пЬ.1ВК 1 И 1В в 24 (О - 38) ацетоном в соотношении1: 1, отде. ец)ц ее цецтрифугцровдциемсуспецдровдцц) в буйере. Суспецэиюбиомассы обр;)бдтывдют препаратом р-)ацетилглнкс)эдицддэ до пере)зодд экэо11 - апет)ц цпкоэамициддэы в растворимое состояние, потом гелем йосфата кальция, для образования котороговносят 8 об,% х)ористого кальция,йильтруют в присутствии 8 об,% йильтроперлитд. 11 олу .еццый Ьильтрат обессоливают пиаф)и.трдце), йермент очищают хроматографией ца депротеиниэи)роваццом хитице, где сорбцию ферментапроводят прц рП 3,5 - 4,0, а элюциюпри рН 4 - 10,П р и м е р 1. Препарат выделяютиэ культурдльцой жидкости Вас.эцЬ 111 С. Берут 6300 см культуральной жидкости с активностью 56 мед/сми осаждают биомассу 6300 см ацетона,охлажденного до 10 С (соотношение 1:1)25Осадок отделяют центрифугированиемпри 3000 об/мин, 1 ентрифугат отбрасывают.Полученную биомассу с активностью3200 мед/г суспендируют в 500 см фос.фатного буфера (рН 7,0), добавляют 3 гбактериальной -И-ацетилглюкоэаминидазы с активностью 10000 ед/г. Суспензию ицкубируют в течение 2 ч при20 С при перемешивании. Добавляюто80 мл 50%-ного раствора хлористогокальция, потом наливают 270 см насыщенного раствора йосйорнокислоготрехзамещенного натрия (рН смеси 7,1),В качестве фильтрующего агента добавляют 8 об.% (40 г) Фильтроперлита.Суспенэию хорошо перееиивают и фпльтруют под вакуумом. Получают 600 смФильтрдта с 3 -)1-дцетилглюкозаминидазцой акти)пост ья) 329 мед/см . Выход 45по активности 61%.Влияние условий обработки препаратом -11-ацетилглюкозаминидазы на показатели процессов приведено в табл. 1.В примерах 1 - 5, результаты кото)ых приведены в табп. 1, изучаетсявлияние обгдботки биомассы хлористымкальциел и присутствия перлита нафильтрацию и диафильтрацию. Иэ табл.1видно, что обработка биомассы 8 об Лхлористого кдпьция и добавление8 об.% перлита дает лучшие результа -ты по фильтрации. Однако в диалиэироваццом Ьипьтрате образуется осадок. В цримерлх 6 - 9 суси: цзцю бдсс); сначала обрабатьи)дют раэц),и) копчг - ствами препарата -11-апет) глюкоэаминицазы, а потом - ранее )добра)ным оптимальным количеством хлористогокдльцця и перлита, затем подвергают Фильтрации и диайнльтрации. Обработка биомассы препаратом -Я-ацетилглюкоэамицидаэы в количестве от 2 до 4 г оказывает существенное влияние ца диафильтрацию. Диалиэированный йильтрат получают без осадка, а выход-11- ацетилглюкозаминидазы увеличивается в 2 разаНа основе исследований приняты следующие условия Фильтрации: суспензию биомассы обрабатывают в течение 2 ч препаратом (3-11-аиетилглюкоэамицидазон в количестве 2 - 4 г, добавляют 8 об.% хлористого кальция и насыщенным раствором фосфорнокислого трехзамещенного натрия доводят рН смеси до 7, 1, а потом вносят 8 об.% перлита и проводят фильтрацию.Дпя обессоливания и подготовки фильтрата для хроматограйии проводят диафильтрацию на проточной ультрафильтрационной установке, используя УАМмембраны.Процесс проводят следующим образом.В бачок заливают 600 см фильтрата, включают насос, создают на ультра - фильтрационном аппарате при помощи регулирующего вентиля давление О, 15 МПа. Фильтрат циркулирует через ультрафильтрационную ячейку и возвращается в бачок, ультрафильтрат (жидкость, прошедшая через мембраны) собирается в отдельный сосуд. Сначала концентрируют исходный йильтрат до 320 см, потом концентрированный фильтрат разбавляют 0,00 1 М универсальным буфером (рН 4,0) до исходного объема и снова проводят диафильтрацию. По описанной схеме диайильтрацию ,проводят с шестикратным разбавлением исходного фильтрата. Низкомолекулярные вещества и соли переходят в фильтрат, а биополимеры с мол.массой более 100 тыс. дальтон остаются в концентрате. В результате этой операции получают прозрачный диализированный раствор фермента объемом 84 см, активностью 1500 мед/см, со степенью очистки 544 раэ, выходом 47%.671691 рт1 я 1. Способ получения (3 - ;1-ацетилг ив 5козаминидазы Бас 11 цз з ЬТ 1 в 3 К 111В, включающш отделение бпомасыцентрифугированием, с успе нд р ованпеее в буфере, диафильтрацию и хрома го -графическую очистку, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью увеличс -ния выхода целевого продукта и упрощения способа, биомассу перед центрифугированием осаждают ацетоном в со -отношении 1:1, суспензцю биомассы об рабатывают препаратом-И-ацетилглюко -заминидазы до перевода зкзо-ф-И-ацетилглюкозаминидазы в растворимое сос-.тояние,затем гелемфосфата кальция полученный растворфильтруют,а хромато графическую очистку проводят на депро 3. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что фильтрацию ведут 30 в присутствии фильтроперлита в количестве 8 об.7. Таблица 1 Пример Обработка суспензии биомассы ПродолжиПоказатели дпализа тель-И-Ацетилглюкозаминидаза Количество СаС 1,Е,образования кальцийфос- атного КоличестОценка наосадок Выход по ность фильтрации, мин активности, я. от фильтво перлита, 7. Количе- Общая акство, г тивность,рат ел е фильт -уется 44,4 4 Образ уе ся осад 45,5 44,0 45,0 50,0 88,3 86,4 87,4 400 180 120 120 120 8 5 3 о же 1 11 8 8 0000 0000 Беэ осакаТо же1 8 8 8 30000 40000 8 0 Загрукант колонку с депротепнизированным хитпном в объеме 50 см и уравновешивают универсальным буфером 0,001 Г (рН 4,0). 11 а колонку наносят 84 см дидиализированного раствора фермента. Далее проводят элюцию фермента тем же универсальным буфером (0,001 М) в градиенте рН от 4 до 10. -Г 1-Ацетилглюкозаминидаза элюируется в диапазоне рН 4,2 - 7,0. фракции объединяют и получают 69 см элюата с удельной активностью 1225 мед/г белка, степенью очистки 2245 раз, выходом 247. Далее элюат лиофилизируют и получают 0,5 г препарата с удельной активностью 25 ед/мг белка.Характеристики основных этапов выделения высокоочищенного фермента -И-ацетилглюкоэаминидазы представлены в табл. 2.При использовании предлагаемого способа получения высокоочищенного препарата-Я-ацетилглюкозаминидазы повышается выход в 10 раз, а также упрощается способ выделения благодаря обработке биомассы ферментативным, химическим путем и афинной хроматографии на хитине. При этом исключаются этапы центрифугирования, гель- фильтрации и ионной хроматографии. теинизированном хитине 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что для образования геля фосфата кальция использ уют 8 об . ь хлористого кальция .1671691 Табиииа 0 б ем смЗ Продукт; процесс Выход, 7. Очистка,Удельная активность, медмибелка раз Культуральиая жидкостьВ.вцЪс 111 в 0-38 6300Оуспензпя биомассы 500Ферментативиая и химическая обработка биомассы и Фильтраци 580ДиаЖильтрация 84ХроматограФия на хитине 69Известный способ 40000Выделение из В.вцЪ 111 в Спо схеме известного способа 1,051,0 100,0 91,0 6,3320 134,0543,62245,0.7000,0 55,6 35,8 24,02,1 84315001392023300 3225,0 20156 Составитель И.ЧаплинаТехред М.Дидык , Корректор С.Ыекмар Редактор И.1 ербак Заказ 2803 Тираж 352 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул, Гагарина, 101