Способ очистки оксидазы д-аминокислот

О П И С А Н И Е 11,722 о 5ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз Советских Социалистицеских Республик(32) 22 тет осударстаенныи кометеСовета Мнннатраа СССРаа делам нзааретеннйн аткрытнй(45) Да опубликования описания 25,07 72) Авторы изобретен ИностранцыОноре Мазаргий, Франсуа Мейе и Пьер Мопса(фрак ИНОКИСЛОТ 54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ОКСИДАЗЫ химическ токислот,гликоля 5-35 об. % Минеральный иос роокисей или други еральных соедицец ценные или незамещ ель со т из окисеи,мых и пористых ераствср ца кото ы О-амииорафическогоей оксилазуеля фосфатапер ек ристалта аммония ых привиты за ме сил нные группы галоидалкил я модификации жащийся в носите- ЙН - (СН, ), - ЙН носителя зае, остатком- (СН),вают носи алоид мешают гформулы-СООН.ь, замещецнь сод 1 а колонке с ерекристалВ этом случае обрабать алоид илсилац(СН, ),известно иле нии, м, соедицени- Л 1 Н - (СН, ) рмулы ООС, Н,1 ости в суспецидролиз в присут. й кислоты, в осо. ЙН по любо зии приОпцако известиыи спосвязац с использовали об труцоемок, длителен и хрома тографических ус 1 ойчивы к действию и методике,и проводятецгрировацц цоситепец, которые малотепла ц давления и легко твии л ои аэро ц 1 аются при загряз.1 о це п 11 зцопяет примеас 1 пгабах.процесса цредпгп ается мнцсрапьцый цоситепь, цпй о,.1 дток, зал 1 ещец. ецности соляио Для очисгки пении микроо гацизмами, ьаппсц,цпх л уцрошеция ццосцт 1, на 1 К ПП К С ИПЦП мицокислот хромапцяот моцифици ксидазы О а яп его в цр тографическую колоцку зало ровацным носителем, суа 1 е 1 цир имеющем рН, при котором це вации ферл 1 енга, и чере 1 копоцк белков, содержгпцую оксмазу буферном растворе. Копоцку цр оваццыл 1 в буфере, 1 роисходит ццак гисмесь белков содержащий а ц 1 пй 1 РУцпой 11 к-.ЙН (С пропускаюг смеси цаходящун 1 ся рмупы г. -( .госл 111 вают волои ц 1Иэобретеиие относится к способу очистки окс дазы О аминокислот, примецяемои в промыцне 1 п 1 ости для получения а-ке частности пировицоградцой кислоты.Известен способ очистки оксидаз кислот путем двукратного хромато 1 разделения смеси белков, содержаш О аминокислот, ца колонке со смесью 1 кальция с целлюлозойс поспеду 1 ошей лиэацией белка в присутствии сульфа растворециел 1, хроматографировацием 1 гелем Сефадекса Сзх 75 и повн орной 1 лизацией,и проводить отделение оксидазы в среде этилен. гликоля, предпочтительно при концентрации эти572205 Составитель А. БочаровТехРед И, Асталош Редактор Т, Карганова Корректор И. Гоксич Тираж 553 Поднисное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская набд. 4/5Заказ 2232/58 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 3удаления неактивных белков, а затем вводят рао твор этилангликоля о концентрацией менее 50 об, %. Практически активность очищенного фермента равна первоначальюй активности смеси бел. ков.Применяемые реагенгы могут быть получень, известными способами,П р и м е р. К 230 мл пер емешиваемого водного, раствора серной кислоты (: 120 г/л) добавляют по каплям водный раствор силиката натрия (220 гД ЗЮ,), при рН 3,8 добавление силиката натрия прекращают, добавляют 2 капли алкилсульфоната натрия, вьшиваюг полученный золь в 8 л сильно перемешиваемого трихлорэтилена, наблюдая осаж дение шариков гидрогеля, добавляют 1 л аммиачной воды (рН 9) и фильтруют.Шарики промывают 33 раза 0,1 н. соляной кислотой и водой. Полученный гидр огель содер. жит 80% воды.120 г гидрогеля, 15 г триэтоксииодпропилсилана и 200 мл бензола нагревают до кипения и в течение 3 час удаляют 95 мл воды (азеотропная отгонка), После охлаждения образовавшийся про. дукт обезвоживают, промывают ацетоном, сушат и получают привитой кремнезем с группами иодпропилсилана, содержащий 2,1 вес. % иода. Размер час. тиц менее 200 мк, уд, поверхность 425 м /г, объем пор 1,1 мл/г.11 г привитого кремнезема вводят в 25 мл бен. зольного раствора, содержащего 1,5 г соединения нагревают дисперсию 24 час с обратным холодильником, охлаждают, отфильтровывают кремнезем, промывают его этанолом (удаление непрореагиро вавшего соединения) до обесцвечивания раствори. теля и затем водой.Полученный продукт и 50 мл 4 н. соляной кислоты кипятят 24 час, охлаждают, отфильтровывают шарики, промывают их дистиллированной водой и добавляют буферный раствор пир офосфата до рН 8,6. Фиксированное количество соединения - 1 г. 4В хроматографическую колонку загружают 11 гполученного привитого модифицированного крем.незеьа и со скоростью 9 мл/час пропускают 5 мл0,2 М буферного раствора пирофосфата (рН 8,5),содержащего 150 мг смеси белков, включающейоксидазу О. аминокислот,Для расвора, выходящего из колонки, опреде.ляют ферменгативную активность путем добавле.ния о. аланина в 0,2 М буферном растворе пирофос.1 р фата (рН 8,3) и динитрофенилгидраэина с постюдующим спектрофотометрированием при 440 нм.Раствор не обнаруживает активности, что указываетна полную задержку оксидазы на носителе.Затем через колонку с той же скоростью про.пускают воду до тех пор, пока спектрофотэметрирование раствора, выходящего иэ колонки,при 280 нм не подтвердит отсутствие неактивныхбелков.Неактивные белки составляют 90% от всегоколичества белков.Потом через колонку со скоростью 9 мл/часпропускают 20 мл буферного раствора пирофосфата (рН 8,5), содержащего 30 об.% зтиленглико.ля, и определяют ферментативную активность элюата, Активность злюата составляет 90% от актив.ности исходной смеси. Коэффициент обогащения100,Формула изобретения 1. Способ очистки оксидазы Оаминокислотпутем нанесения смеси белков, содержащих указанную оксидазу, на носитель с последующим отделением фермента от носителя, отличающийся 8 тем, что, с целью упрощения процесса, в качественосителя применяют минеральный носитель, содержащий алкилсилильный остаток, замещенный группой- МН - (СН, ), - НН - (СН, )СООН а отделение фермента проводят в среде этиленглнколя,2. Способ по и. 1, от лича ющ ий ся тем,что применяют этиленгликоль при концентрации 5 - 35 об,%,45