Способ получения рибонуклеозид-5 -монофосфатов, меченных изотопами с или н

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Сфаетсиик Сеа 1 иалнстичесиих Республик(бЦДополннтельное к авт.саид-ву(22) Заявлено 3011,73 (2) 1973774/04с присоединением заявки йо(51)М. Кл.з С 07 Н 19/02 Госуяарстаеяяцй конятет СССР ло яеааи язобветеяяй я открытяйОпубликовано 070 о 81 Бюллетень йо ЗЗДата опубликования описания 670981 Ю) УДК 547,963. 3,.26.118,07(72) Авторы изобретения П,П.Пумпен и Э.Я.Трен Ордена Трудового Красного Энамени институт органического синтеза АН Латвийской ССР Ф (71) Заявитель/Ц В. ф ДЩ Изобретение относится к области получения меченых природных соединений, а именно к новому спЗособу получения меченых Сили Н рибонуклеоэид-монофосфатов - компонен 1тов РНК,Эти соединения могут быть использованы для различных исследований в области биохимии, молекулярной биологии и медицины.Известен принцип фосфорибоэилирования аэотистых оснований как пуриновых, так и пиримидиновых), входящих в состав нуклеиновых кислот. Индивидуальные Ферменты осуществляющие данные превращения, выделены и очищены в различной степени.Однако каждый Фермент осуществляет лишь одну соответствующую реакцию,и следовательно, применение какого-либо фермента для создания общего способа получения различных рибоиукле- оэид-монофосфатов невозможно.Известно также использование сложного биологического катализаторабесклеточного экстракта Вгеч 1 Ьас 1 ег 1- яп аввоп 1 едепез - для синтеза раэ 1личных рибонуклеозид-монофосфатов.Однако этим способом удается лишь осуществить йерментативный синтез 2уридин-монофосфата и получить незначительное количество аденозинмонофосфат.С целью усовершенствования известного способа и создания общегоспособа получения меченых нуклеотидов, пригодного,для синтеза различных нуклеозид-монофосфатов иэ соответсцующих меченых оснований, предложен способ получения меченых рибонуклеозид-монофосфатов, заключающийся в том, что меченое основаниеподвергают фосфорибоэилированию вприСутствии ферментной фракции бесклеточного экстракта Езсйег 1 сМасоЮ 1 АВ 259 НтГЗООО, Процесс протекает, как и в известном способе, при37 оС в присутствии 5-фосфо-Д-рибоэил 1-пирофосфата и ионов магния при рН 2 О . 7,8, Выходы иуклеозид-монофосфатов (в расчете иа меченое основание).практически количественные. В качестве катализатора процесса в предложенном способе используется бесклеточный экстракт иэ Е сов 1.Высокие выходы целевых продуктовпозволяют осуществлять синтез важнейших меченых рибонуклеозидмонофосфатов .в препаративных количест ЗО вах530520 формула изобретения Составитель А.Кост Редактор Н.Потапова Техред М Табакович Корректор В. СиницкаяЗаказ 6671/58 Тираж 397 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРподелам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, РаушскаЯ наб., Д. 4/5в М Мевювтютфилиал ППП Патентф, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 П р и м е р ы. Приготовление бесклеточного экстракта Е со 61 АВ 259 Н 1 г 3000Растирают клетки Есог 1 со стекаяиным порошком, разбавляют полученную массу двукратным объемом буфера (0,1 М трис-НС 8; рН 7,8 г 0,05 М5 МАСС ), вносят 0,01 мг/мл раствора диэоксирибонуклеезы, центрифугируют 20 мин при 10000 об/мин. Надосадочную жидкость подвергают ультрацентрифугированию при 100000 д в течение о 1 ч. Экстрат замораживают и хранят при -20 С.Синтез рибонуклесэид-монофосфатов..Реакционная смесь содержит, М 510. актрис-НСР, р 7,8) 1,2 10 ф МЯСО 1 0,6 10-З Сф или Н - основание3 10 9 5-фосфорибозил-пирофосфат и 0,15 мл экстракта на 1 мл смеси.Время инкубации при 37 С 10 мин при фосфорибозилировании аденина и гуа- Я нина или 30 мин.при Фосфорибозилировании урацила, 5-фторурацила и цитозина. Инкубацию прекращают, помещая смесь в кипящую водяную баню на2-3 мин. Образовавшийся осадок уда ляют, конечный продукт выделяют при помощи препаративной бумажной хромотографииг после концентрирования при 35 Р С смесь наносят на бумагу % 3/10 ОЕ на 1 см стартовой линии) и хроматографируют в системе иэомаслянаякислота вода и концентрированнаягидроокись аммония (ббг 33 г 5) нисходящим способом в течение 20 ч. Хромо 4тограммы.сушат и повторно подвергают нисходящей хромотографии в системе й -бутанол,ацетон, уксусная кислота 5-ный раствор гидроокиси аммония и вода (9 гЗг 2 г 2 г 4) в течение 15 ч. Зоны нуклеозид-монофосфатов вырезают и элюируют водой.С целью .получения продукта в виде амониевой соли элюат обрабатЫвают катибнитом Дауэкс 50 (Н+), смолу отфильтровывают, фильтрат нейтрализуют 5-ным раствором гидроокиси аммония)г случае необходимости раствор концентрируют, замораживают и хранят при -20 ОСПодвижности полученных препаратов на бумажных.хроматографах, а также основные. характеристики. уф-спектров соответствуют величинам, характерным для стандартных соединений. Способ получения рибонуклеозид- .5-монофосфатов, меченых изотопами С"4 или Н, вэагвгодействием соответствующих меченых оснований и 5-фосФорибозил-Ьпирофосфата под действием Ферментативного катализатора при 35- 40 дС и рН 7,8 в присутствии 0,05 М трис-,НСЕ и 0,01 М МдСЕ с последующим выделением целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве катализатора применяют Ферменты Езсйег 1 сМа со 01 АВ 259 НГг 3000,