Способ получения 5″-нуклеотидов

(и) 521281 Союз Советских СЬциаяистических Реснублик/04 4257 ееударстееииь 1 й иамитеВвэетв Ииииетров ССе делам иеееретеиийи вткрьний,-Аиельянчик, Д. Г. Вальховский, С, В,2) Авторы изобретения ементоорганических соединений(5 36, присоеносителю. Изобре ия 5-нук ение как зе лекарст Изве ов путем ииовых ки ом эндо алентно с еорганичевкдоиукде аз нерас творим Водонерастворимая эндонуклваза Аможет быть использована многократно либ в проточной колонке, либо в реакторе с м шалкой, тогда как водорастворимая эндону 1клваза может быть использована лишь однкратно вследствие полной потери активнос ти в процессе гидролиза.Предлагаемый ферментативный гидролиз нуклеиновых кислот позволяет существенноповысить выход 5 -нуклеотидов на, единицу активности фермента. Если при использовании водонерастворимой экзонуклеазы для расщепления 100 мг нуклеиновых кислот требуется 10 ч, то при использовании предварительного гидролиза водонерастворй.чмой эндонуклеазой А, одйн цикл,за-, вершается за О,Ь-Х ч, причем после,отделения нерастворимого фермента от продуктов простой фильтрацией, он может быть опять использован для гидролиза, После 10 циклов иммобилизованная эндонуклеаза Атеряет не более 15% своей актив 10 бстра-.льшоелеая я он ент чтобы сущетолиза иукдов и увена единицу ды полу- рментативоль(22) Заявлено 08 07.74 (2 с присоединением заявки тение относится к способу полулеотидов, которые находят прнпромежуточные вещества в синтевенных препаратов и витаминостен способ получения 5 -нуклеотифермвнтативного гидролиза нукаслот водонерастворимым Ферменуклвазой Аактиномицетов, ивязанным с органическим илиским носителем. ГОднако для полного расщеплента на 5 -мононуклеотиды требуеколичество водонерастворимой экзы Аи много времени, так какдействует только с 3 -конца полцепиПо предлагаемому способу,ственно сократить время ферменлеиновых кислот до 5 - нуклеотиличить выход целевого продуктаактивности фермента 5 -нуклеотичают путем последовательного феногогидролизануклеиновыхкиелотлеазой и экзонуклеазой, При этом ис иикова, Н, М, Абросимовогожин и Р. И. Татарская521281 Ш 11 И 11 И Лака: 1902/514 1 ираж 575 оФП одш си оо Филиал 11 ПП "11 ы гонт", г, Ужгород, ул. 11 роектиая, 1 ности, фермент эндонуклеаза А, присоединенный к водонерастворимому носителю, проявляет до 70% исходной нуклеаэнойактивности, гораздо более устойчив к тепловому воздействию: активность нераствори-, 5мого фермента сохраняется при инкубациипри 50 С в течение 5 ч (при наличии ионов Са в концентрации 10 М), в товремя как растворимый фермент теряет заэто время 90% своей активности 16П р и м е р 1, Макропористый кремнезем силохром кипятят в 0,1-10%-номрастворе-аминопропилтриэтоксисиланав среде органического растворителя в течение 30 ч. Получают аминированное; производное силохрома,К 5 г аминированного силохрома добавляют 2,;5 г хлорангидрида и-нитробензой 4 ной кислоты в 80 мл хлороформаи 2 млтриэтиламина. После перемешения в течение 1 ч при кипении производное высушивают на фильтре, добавляют 1 г дитионита натрия в 10%-ном водном растворе пиридина и перемешивают 1-5 ч при 5090 С, 25Полученное соединение обрабатывают14%-ным водным раствором нитрита натрияв 2,5 н, НС 1 при температуре 0-5 С втечение 0,5-1 ч,Образовавшееся диазопроизводное пере- фмешивают с 10 мл 0,01%-ного растворафермента эйдонуклеазы актиномицетов в01 И трис-НС 1 буферч, рН 8,5, Са+,3=10 .И в течение 4-20 ч нри О 5 С.После этого носитель с присоединенным З 5ферментом промывают 1 М раствором поваренной соли и ледяной водой, Фермент сохраняет до 70% исходной нуклеаэной активности.Ферментолиз нуклеиновых кислот.0,5 г носителя с присоединенным ферментом (-1000 ед. акт/г) загружают всосуд с мешалкой, термостатированныйпри 37 С, Затем добавляют 200 мл 1%-ного раствора нуклеиновых кислот, суммарная дрожжевая РНК в.0,05 М трис-НС 1буфере с рН 7-9, Для действия ферментанеобходимы ионы Мц в концентрации 5 х-Ъх 10 И и ионы Са+в концентрации 1050Под действием фермента происходит расщепление субстрата в течение Ь ч иа олигонуклеотиды, содержашие 70;. кпслстно-1 расторимых фракций, которые подают в проо точную термостатированную при 37 С колонку, емкостью 5 смзаполненнуюводонерастворимым ферментом экзонуклеазойА. Раствор подают со скоростью 15- 25 мл/ч. В конечном гидролизате содержится 90% 5 -нуклеотидов, которые разделяют на ионообменной колонке и лдентцфицируют с помощью бумажной и тонкослойной хроматографии 5 -нуклеотидаэой 1 и по Уф-спектрам.П р и м е р 2, 5 г твердого носите. ля для газо-жидкостной хроматографии. хромосорб Р кипятят в 0,1-2%-ном растворе-аминопропилтриэтоксисилана в органическом растворителе в течение 24 ч Полученное .при этом промежуточное соединение обрабатывают 1-20%-ным водным раствором,глутарового альдегида при температуре 0-5 С в течение 0,51 ч и затем перемешивают с 5 мл 0,1% ного раствора фермента энцонуклеазы актиномицетов р 0 1,И трис-НС 1 буфере ГСа.1=10,М при 4 С в течение 4-24 ч.Полученный водонерастворимый, ковалентно связанный с хромосорбом Р фермент об. ладает 35 / ной исходной нуклеазной актив.ь ностью. Ферментолиз и идентификация продуктов аналогичны приведенным в примере Х.П р и м е р 3. По одному из известных,способов активируют целлюлозу, например полу% р чают диазотированную м-амминобензилоксиме" тилцеллюл озу; 1%-ную суспензию диазотир ован-Вой м-аминобензилоксиметилцеллюлозы. пере- мешивают с 0,1%-ным раствором эндонукле;- зы актиномицетов в течение 4-24 ч приоС, Фермент; присоединенный к целлюлозе обладает нуклеазной активностью.Ферментолиз и идентификация продуктов аналогичны приведенным в примере 1. Формула изобретения 1Способ получения 5 -нуклеотидов путемферментативного гидролиза нуклеиновых кислот экзонуклеазой А, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что с целью увеличения выходацелевого продукта,нуклеиновые кислоты предварительно гидролизуют эндонуклеазой А,присоединенной к водонерастворимому носителю,