Способ получения человеческого адренокортикотропного гормона или его фрагментов

п 1 48382 ИЗОБРЕТЕ Реепублн 61) Зависимый от патента 1) М, Кл. С 07 с 103/52 2412/23-4 Р 1-306 Р 1-317(33) ВНРОпубликовано 05.09.75, Бюллет сударственный комитет Совета Министров ССС по делам изобретений 53) УДК 547.964.4.07(088.8) крытии Дата опубликования описания 26,05.76, Калман Меджирадски, Шандор Баюж,иклош Лов, Золтан Паулау, Ласло Жпорн рги Хайош и Жужанна Ланг(ВНР) Иностранная фирма Рихтер Гедеон Ведьежети Дьяр(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ДРЕНОКОРТИКОТРОПНОГО ГОРМОНА ИЛИ ЕГО ФРАГМЕНТОВИзобретение относится к способу получения 39-членного пептида, являющегося синтетическим аналогом человеческого адренокортикотропного гормона (АКТГ), а также 28- и 32- членных пептидов - фрагментов АКТГ, кото рые могут найти широкое применение в медицине.Известен способ получения многочленных пептидов, например 39-членного АКТГ свиньи, имеющего сходное, хотя и не идентичное 10 строение с АКТГ человека, который состоит в том, что защищенный декапептид 1 - 1 О конленсируют с защигценным нонакозапептидом 1 - 39 в присутствии дициклогексилкарбодиимида в качестве конденсирующего агента с по следующим снятием защитных групп и вылелением целевого продукта известными приемами. Для получения продукта с достаточно высоким выходом применяют трехкратный избыток декапептида 1 - 10 и 8-кратный избыток 20 дициклогексилкарбодиимида. Конденсацию проводят при относительно высокой температуре (50 С) в течение длительного времени (90 в 1 час).Предлагается спосоо получения адренокор тикотропного гормона человека, имеющего следующее строение:Н - сер - тир-сер-мет-глу-гис 1 2 3 4 5 6 лиз - про - вал-гли-лиз-лиз-арг-арг-про-вал-лиз 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 вал-тир - про-асп-ала-гли-глу-асп-глн-сер-ала 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 глу-ала-фен-про-лей-глу-фен-ОН (1 - 39) 33 34 35 36 37 38 39или его фрагментов со строением 1 - 28 и 1 - 32 конденсацией защищенного тетрадекапептида 1 - 14 с защищенным пентакозапептидом 15 - 39 в присутствии двух конденсирующих агентов - дициклогексилкарболиимида и пентахлорфенола - с последующим снятием защитных групп, При этом указанные пептилы берут в эквимолекулярном соотношении, дициклогексилкарбодиимид - в двух- трехкратном молярном избытке, а пентахлорфенол - в 2 - 6-кратном молярном избытке. Реакцию ведут при комнатной температуре в течение 48 - 96 час.Аналогично получают пептидные фрагменты 1 - 28 и 1 - 32, конденсируя исходный пептид 1 - 14 с пептидами 15 - 28 и 15 - 32 соответственно. Применение пептида 1 - 14 в качестве ацилирующей компоненты реакции и дополнительное введение в реакционную среду пентахлорфенола позволяет получить новый продукт - АКТГ человека - в мягких условиях, с высо-. ким выходом и в довольно чистом виде. Кро,у Тираж 529 ЦНИИПИ Изд. Подписное Типография, пр, Сапуноаа, 2 ме того, предлагаемый способ обеспечивает минимальные затраты труднодоступных исход пых пептидов. Так, пептид 1 - 14 берут в соотношении 1: 1 к пептиду 15 - 39, в то время как в известном способе пептид 1 - 10 используют в трехкратном избытке по отношению к пептиду 11 - 39,Пример 1, Синтезчеловека (1 - 39).118 мг (0,06 ммоль) защищенного тетрадекапептида 1 - 14, 202 мг (0,055 ммоль) защищенного тригидрохлорида пентакозапептида 15 - 39, 38 мг (0,144 ммоль) пентахлорфенола и 30 мг (0,145 ммоль) дициклогексилкарбодиимида растворяют в 0,6 мл диметилформамида, содержащего 0,077 мл (0,055 ммоль) триэтиламина, Реакционную смесь оставляют на 4 дня при комнатной температуре и затем разбавляют эфиром, не содержащим перекисей. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат, Полученный продукт хроматографируют па колонке с силпкагелем в системе этилацетат - пиридин - муравьиная кислота - вода (60: 20: 6: 5,6). Фракции, содержащие основной продукт, собирают и высушиваот. Выход защищечного нонатриаконтапептида 1 - 39 136 мг (44/о от теории).П р и м е р 2. Снятие защитных групп и получение свободного ЛКТГ человека.100 мг защище ного нонатриакоптапептида, полученного в примере 1, растворяют в 2 мл трифторуксусной кислоты, полученный раствор выдерживают 15 мин и затем упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 2 мл воды и снова упаривают. Зту операцию повторяют еще раз и сухой остаток растворяют в 5 мл воды, Полученный раствор хроматографируют на колонке со смолой Лмберлит 1 КА=400. Фрак. ции, содержащие свободный ЛКТГ, собирают и лиофнльно высушивают. Выход 80 мг (80 "1 с от теории) .П р и и е р 3. Синтез фрагмента 1 - 28 ЛКТГ человека,0,69 г (0,305 ммоль) защищенного тетраде. капептида 1- - ;4, 0,69 г (0,305 ммоль) тригид. рохлорида тетрадекапептидного эфира 15 - 28 и 0,48 г (1,8 ммоль) пептахлорфенола раство. ряот в 2 мл диметилформамида, добавляют 0,124 г (0,06 ммоль) дициклогексилкарбодиимида и оставляют на ночь при комнатной температуре. Далее реакционную смесь нейтрализуют раствором 0,3 мл (0,125 ммоль) триэтиламина в 1,5 мл диметилформамида и оставляют при комнатной температуре еще на сутки. После этого смесь разбавляют эфиром, не содержащим перекисей, и выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат. Полученный продукт (1,45 г) хроматографируют на колонке с силикагелем в смеси этилаце 10 15 20 25 30 35 40 тат - пиридинмуравьиная кислота - вода (60: : 20: 6: 5,6), Фракции, содержащие свободный октакозапептид 1 - 28, объединяют и упаривают, Выход 0,171 г (13/, от теории), Снятие защитных групп проводят по примеру 2.Лналогично получ,.:от фрагмент 132. Предмет изобретения 1. Способ получения человеческого адренокортикотропного гормона, имеющего строениеН - сер - тир-сер-мет-глу-гис-фен-арг-три-гли 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 лиз - про - вал-гли-лиз-лиз-арг-арг-про-вал-лиз 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 вал -тир - про-асп-ала-гли-глу-асп-глн-сер-ала 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 глу-ала-фен-про-лей-глу-фен-ОН (1 - 39), или33 34 35 36 37 38 39его фрагментов 1 - 28 и 1 - 32, о т л и ч а ющ и й с я тем, что защищенный пептид 1 - 14 конденсируют с одним из защищенных пептидов 15 - 39, 15 - 28 или 15 - 32 соответственно с последующим снятием защитных групп и выделениев 1 целевого продукта известными приемами.2. Способ по и. 1, отл и ч а ющи й с я тем, что указанные пептиды вводят в реакцию в эквимолекулярпых количествах.3, Способ по п. 1, отличающийся тем, что конденсацию проводят при одновременном присутствии 2 - 3 молекулярных эквивалентов дициклогексилкарбодиимида и 2 - 6 молекулярных эквивалентов пентахлорфенола.Приоритет по признакам10.09.66 по признаку:Способ получения фрагмента 1 - 28 кортикотропина общей формулы:сер - тир - сер - мет-глу-гис-фен-арг-три-гли-лизпро-вал-гли-Я, где Я-лиз-лиз-арг-арг-про-валлиз-вал-тир-про-асп-гли-ала-глу.28.03.67 по признаку:Способ получения кортикотропина человека общей формулы:Н-сер-тир-сер-мет-глу-гис-феп-арг-три-гли 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 лиз - про - вал-гли-лиз-лиз-арг-арг-про-вал-лиз 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 вал - тир - про-асп-ала-гли-глу-асп-глн-сер-ала 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 глу-ала-фен-про-лей-глу-фен-ОН33 34 35 36 37 38 39о т л и ч а ю щи й с я тем, что защищенный пептид 1 - 14 конденсируот с защищенным пептидом 15 - 39 в присутствии карбодиимида и пентахлорфенола с последующим снятием защитных групп и выделением целевого продукта в свобсдчом виде или в виде соли, или комплекса известным способом.