Способ выделения пектолитических ферментов

СРМЮ.т-:;,:. ОПИСАНИЕ" ИЗОБРЕТЕНИЯ з,; , гт т с 00 480721 Союз Советских Социалистических Республик(61) Дополнительное к авт. свид-ву 51) М. Кл. С 07 д 7/О 1950392 2 2) Заявлено 25.07.7 с присоединением заявки г"е23) Приоритетпубликовано 15.08.75. Бюллетень Мо Го суда р стае ни ы й к ом ит ет Совета Министров СССРпо делам изобретенийи открытий 3) УДК 577,15.0ата опубли пия описания 26,01.7(72) Авторы изобретени М. Трефилов И. Орещенко, Л, И. Голгер, К. А. Калунянц,и Н, Г. ГаеваяВсесоюзный научно-исследовательский институбелковых веществ 1) Заявитель иосинтез 54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПЕКТОЛИТИЧЕСФЕРМЕНТОВ о- пт 25 Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промышленности и может быть использовано при производстве пектолитических ферментных препаратов.Известны способы выделения пектолитических ферментов, заключающиеся в том, что экстракты из поверхностной культуры или культуральную жидкость концентрируют в вакуум-вьвпарных аппаратах, и из концентрата ферменты осаждают органическими растворителями, таннином и высаливаются нейтральными солями. Однако в известных способах значительны потери ферментов в процессе их выделения.Процесс концентрирования культуральной жидкости или экстрактов сопровождается потерями ферментативной активности до 20 опри концентрировании в 5 - 6 раз, а при концентрировании в 10 раз потери значительно возрастают. Кроме этого невозможно получение препаратов с высокой степенью очистки. В упаренном концентрате полностью остаются все балластные вещества (инертный белок, сахара, аминокислоты, соли, пигменты и др.). Для процесса выделения требуется сложная аппаратура. Процесс длителен во времени и сопровождается значительным расходом пара, воды и электроэнергии.С целью повышения выхода и активности ферментов концентрирование культуральной жидкости осуществляют ультрафильтрацпеи на мембранах, при этом перед ультрафильтрацией рН культуральной жидкости устанавливают 3,8 - 4,0. Ультрафильтрацию осуще ствляют на мембранах из диацетата целлюлозы с величиной пор от 40 до 60 А.Спосоо выделения пектолитических ферментных препаратов осуществляют следующим образом.10 Культуральная жидкость после фильтрациии сепарирования подщелачивается аммиаком до рН 3,8 - 4,0 и концентрируется путем пропускания через мембраны из диацетата целлюлозы с величиной пор от 40 до 60 А, при 15 этом отделяются низкомолекулярные вещества (до мол. вес. 25000) и вода от концентрата, содержащего более высокомолекулярные вещества, Потери ферментативной активности пе превышают бе .20 Для осаждения пектолитпческих ферментовиз концентратов, полученных методом ультра- фильтрации, необходимо скорректировать рН до 4,8 - 5,3.Осажденный одним из органических растврителей, например этанолом, ферментпь препарат высушивается общепринятыми методами. Активность препарата 20000 ед/г, тогда как препараты, получаемые по существующей технологии, имеют активность 5000 - 30 8000 ед/г,480721 Таблица Активность пектиназы Объем,Степень очистки, кратность Наименование всегоединиц ед/мл мл 51,0 629,8 2100Культуральная жидкостьКонцентратОчищенный препарате 51,0 890 28000Культуральная жидкостьКонцентратОчищенный препарат 48,5 1340 21500209,7443 Культуральная жидкостьКонцентратОчищенный препарат в Вес дается в граммах. Составитель И. Гаевая Редактор Г. Мозжечкова Техред Т. Миронова Корерктор О. Тюрина Заказ 33788 Изд. Уе 1669 Тираж 529 Подписное Ц 1-1 ИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изооретеипй и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская иаб., д 415Типография, пр. Сапунова, 2 П р и м ер. Культура плесневого гриба Азрегр 11 цз окатог 1 16 выращивается на питательной среде следующего состава, % . сульфат аммония - 0,7, однозамещенный фосфат калия - 0,1, сернокислый магний - 0,05, 3,5% -ный экстракт свекловичного жома - 95 мл на 100 мл питательной среды и 10%-ная вытяжка солодовых ростков - 5 мл на 100 мл питательной среды. Длительность роста - 3-е суток, активность культуральной жидкости - 50 ед/мл содержание сухих веществ - 2,5%, рН 3,0 - 3,3. После отделения мицелия гриба в фильтрат культуральной жидкости, предварительно отсепарированной,Таким образом, предлагаемый способ получения пектолитических ферментов позволяет снизить потери ферментативной активности в 3 - 4 раза и повысить активность препаратов с 5000 ед/г до 20000 ед/г; степень очистки препаратов повышается в 3 - 4 и более раз, Значительно снижаются энертозатраты, а также расход органических растворителей, например этанола, в 2 и более раз на осаждение. Длительность процесса сушки сокращается в 2,2 - 1,3 раза,Предмет изобретения1. Способ выделения пектолитических ферментов путем концентрирования культуральдобавляется раствор аммиака для доведения рН до 3,8 - 4,0, и производится ультрафильтрация на мембранах из диацетата целлюлозы с размером пор от 40 до 60 А. В результате происходит концентрирование в 10, 20, 30 и более раз. В процессе ультрафильтрации происходит очистка за счет удаления низкомолекулярных веществ. рН полученного концентрата корректируется раствором аммиака до 4,8 - 5,3. Фермент осаждается при добавлении этанола до концентрации 75, Осадок отделяется путем центрифугирования и высушивается. Результаты опытов приведены в таблице. 15 ной жидкости с последующим осаждениемферментов органическим растворителем, например, этиловым спиртом, о т л и ч а ю щ и йся тем, что, с целью повышения выхода иактивности ферментов, концентрирование20 культур аль ной жидкости осуществляютультрафильтрацией на мембранах, при этомперед ультрафильтрацией рН культуральнойжидкости устанавливают 3,8 - 4,0.2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем,25 что ультрафильтрацию осуществляют на мембранах из диацетата целлюлозы с величинойпор от 40 до 60 А.Приоритет по пункту 2 установлен от13.9.74 г,