Способ получения дез-аланин-в-30инсулинов

: Ъо.О П ИЙйА-:-Н-И Е п 11 469686ИЗОБРЕТЕН ИЯ Своз Советских Социалистических(32) Приорите Государственныи комитет Совета Министров СССР публиковано 05 3) УДК 77.17.07,088.8) 5. Бюллетеньописания 08.08.75 о делам изобретени та опубликова открытии 2) А торыбр стени О ф. Кривцов и Ю. П. Швачки инск 71) 3 вител ститут экспериментальнои эндокринолог и химии гормонов АМН СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИ пособу получения ладающих полной соответствующих личающихся от ми свойствами. 5 я дез-алании-В"- емого карбоксиого отщепления нсул и нов.и продуктами об аспар агин-Ае-иняется и загрязняС целью повышения степени чистоты целе вого продукта предлагается гидролиз природного инсулина, катализируемый карбоксипептидазой А, проводить в водном растворе, содержащем 40 - 60 об. 7 О органического растворителя, например этанола, при нагревании, 2 преимущественно при 30 - 50 С, с последующим выделением целевых продуктов известным способом.П р и м е р. 1,2 г кристаллического свиного инсулина при 40 С растворяют в 55 мл 0,1 н. 2 трис-буфера (рН 8,5), приливают 45 мл этанола, нагревают до 40 С, добавляют 1,2 мл суспензии карбоксипептидазы А, содержащей 0,1 г фермента (фирма Реанал, ВНР) в 4,4 мл, инкубируют 4 час при 40 С, добавляют 3 Аминокислотный соста алании-В"-инсулина и и сулина определяют на ам заторе типа Унихром в полученного дезходного свиного ининокислотном аналифирмы Бекман ФРГ) Изобретение относится к с дез-алании-Во-инсулинов, об биологической активностью природных инсулинов, но от них своими иммунохимическиИзвестен способ получени инсулинов путем катализир пептидазой А гидролитическ аланина-В" от природных иОднако наряду с целевым разуется дез-алании-Во-дезсулин, который трудно отдел ет целевые продукты. еще 1 мл суспензии карбоксипептидазы А и кубируют 3 час при 40 С. К смеси прибавляют 5,7 н. соляную кислоту до рН 3, упаривают до объема 25 - 30 мл, оставляют на 2 - 3 час при 0 - 4 С и отделяют неактивную карбоксипептидазу А центрифугированием. К фильтрату добавляют сухой трис-(оксиметил)-аминометан до рН 8,0, наносят раствор на колонку (40(3,5 см) с Сефадексом 6-25, предвари. тельно уравновешенную 0,05 М раствором би. карбоната аммония, и алюируют этим же бу. ферным раствором, собирая фракции по 5 мл. Содержание белка во фракциях определяют спектрофотометрически при 278 нм. Фракции, содержащие белок, объединяют и лиофильно высушивают. Выход целевого продукта 1,15 г, При электрофорезе (750 в, 2 час) на бумаге в 0,1 М растворе лимонной кислоты, содержащем 4 моль мочевины, полученньш дез-аланинВзо-инсулин движется однородным пятноъ 1, подвижность которого аналогична подвижности исходного свиного инсулина. Дез-аланинВзо-инсулин выделен в аналитически чистом виде с выходом, близким к количественному.469686 Составитель Л. Фонина Техред Г. Дворина Корректор Л. Котова Редактор Т. Шарганова Заказ 192219 Изд. Мо 669 Тираж 529 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж.35, Раушская наб., д, 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 3Полученный дез-алании-В"-инсулин и исходный свиной инсулин содержат в остатках (теоретически) 1,00 (1) и 1,00 (1) лизина;1,94 (2) и 1,93 (2) гистидина; 1,00 (1) и 1,00 (1) аргинина; 3,00 (3) и 2,93 (3) аспарагиновой кислоты; 1,68 (2) и 1,71 (2) треспина; 2,58 (3) и 2,83 (3) серина; 7,39 (7) и 7,27 (7) глютаминовой кислоты; 0,98 (1) и 1,07 (1) пролина; 4,00 (4) и 4,00 (4) глицина; 1,07 (1) и 2,03 (2) аланина; 5,22 (6) и 5,21 (6) /,цистина; 3,91 (4) и 3,89 (4) валина; 1,75 (2) и 1,71 (2) изолейцина; 6,09 (6) и 6,15 (6) лейцина; 3,80 (4) и 3,79 (4) тирозина и 2,88 (3) и 2,89 (3) фенилаланина соответственно.При определении содержания аминокислот в остатках для каждого инсулина за единицу принята /4 содержания глицина. Гидролиз дез-алании-В"-инсулина (4 мг), катализируемый карбоксипептидазой А и проводимый в 0,1 н. трис-буфере (рН 8,5) в течение 2 час при 37 С, приводит к отщеплению только аспарагина (0,35 мкм), как С-концевой аминокислоты.В аналогичных условиях гидролиз свиного инсулина сопровождается отщеплением аспарагина (0,31 мкм) и аланина (0,47 мкм).Таким образом, под действием карбоксипептидазы А в предлагаемых условиях от свиного 5 инсулина отщепляется единственный аминокислотный остаток - остаток аланина, занимающий положение 30 в цепи В. Предмет изобретения 101, Способ получения дез-алании-В"-инсулинов путем гидролитического отщепления аланина-Взо от природных инсулинов, катализируемого карбоксипептидазой А, о т л и ч а ю щи й с я тем, что, с целью повышения степеничистоты целевого продукта, гидролиз природного инсулина, катализируемый карбоксипептидазой А, проводят при нагревании в водном растворе, содержащем 40 - 60 об.% органи ческого растворителя, например этанола, споследующим выделением целевого продукта известным способом.2. Способ по п, 1, отличающийся тем,что процесс ведут при 30 - 50 С.