411125

Ьсесо озн"пеп е и т циййО Й Е 4 В 25 Союз Советских Социалистических РеспубпикЗависимо Заявлено от авт. свидетельстваИ, 1(л. С 12 д 13/1.И,1972 ( 1775219 цсоединением заявки-ПриоритетОпублггковацо 15.1.1974. Бюллетень2Дата опубликования описания 1 Х 1.1974 осударствеииый комитетСовета Министров СССРоо делам изобретенийи открытий К 577,15.08(088.8 Авторыизобретения А. Люблинская, Л. С, Яновская,и В. М. Сге научно-исследовательский промышленных микА, Я, Стрпнгин, Е.апов евт институт генетикоорганизмов ц итель есоюзныи селекцт СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВАЩЕЛОЧ НОЙ ПРОТЕИ НАЗБ 1 В РАСТВОРЕСОДЕРЖАЩЕМ КОМПЛЕКС ФЕРМЕНТОВ Изобретение относится к области микробиологии, а именно к способам определения количества щелочной протеиназы в растворе,содержащем комплекс ферментов.Известен способ определения количестващелочной протеиназы в растворе, содержащем комплекс ферментов, предусматривающий введение раствора в предварительно приготовленную реакционную смесь, содержащуютрис-НС буфер, хлористый кальций, и субстрат, с последующим инкубированием полученнои смеси и введением реагенаа, останавливающего протеиназный гцдролиз субстрата,С целью повьппения точности и упрощенияпроцесса определения количества щелочнойпротеиназы по предлагаемому способу в качестве субстрата в реакционной смеси используют и.цитроанилид карбобензокси-глицилглицил.-лейцина, а количество протеиназыопределяют по количеству выделиьшегося впроцессе гидролиза п-нитроацилица с последующим расчетом, например, по калибровочной кривой,В качестве реагецтаосг анавливающегопротеиназный гидролиз субстрата, используют2 М цитратцый буфер, а рН тряс-НС буфераустанавливают равным 8,5.Предлагаемый способ осу",цествляют следующим образом. Сначала пригоа авливают реакционнуюсмесь, содеркащуго трис.С буфер, хлорцстый кальций и субстрат, и вводят в нее раствор, содержащий комплекс ферментов.5 В качестве субстрата в реакционной смесииспользуют ц-ццтроаццлцд карбобецзокси-глицил-глицил,-лейцина,Далее полученную смесь цнкубцруют и вводят реагент, останавливающий протеиназный10 гидролиз субстрата, в качестве которого используют 2 М цптратный буфер, при этом рНарис-НС буфера устанавливают равным 8,5,(оличесгво проаеиназы определягот по коли.честву выделившего в процессе гидролиза гг.1 ццтроанилина и затем расс гцтывают по калибровочной кривой.Способ апробирован в лабоэаторных условиях и поясняется примером его выполнения,П р и м е р, Испытания проводят с оцопра 20 зой - препаратом субтцлизица ЬРго Марагве.Нерастворимый наполнцтель, содержащийся впрепарате бцопразы, перед испытанием отде.ляют центрцфугированцем при 3000 обгмцн втсчснце О миц, В надосадочцой жидкости25 определягот концеггтрациго белка по поглощению при 278 нм, используя коэффициент молярной экстинкцци 11,7,Затем 2 мл 50 мМ трцс-НС 1 буфера прирН 8,5, содержащего 2 мМ СаС 1, помещают411125 Составитель А, Бражникова Техред Г. Васильева Редактор В. Блохина Корректор Н. Торкина Заказ 1213/3 Изд.1237 Тираж 456 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5Типография, пр, Сапунова, 2 в термостат при 40 С. Через 10 мии добавляют 0,5 мл 3 мМ раствора хромогепного субстрата в диметилформамиде.Хромогеиный субстрат л-питроанилид карбобензоксиглицил-глицил,-лейцина получают конденсацией карбобеизоксиглицил-глицина с и-иитроаиилидом Е-лейци 1 а.После добавления субстрата смесь инкубируют несколько минут при 40 С, после чего добавляют при тщательном перемешивании 0,5 мл раствора биопразы с конечной концентрацией в пробе 10 - 100 мкг/ мл и инкубируют 30 мин.Затем реакцию останавливают добавлением 1 мл 2 М цитратного буфера рН 5,0.Контролем определения служит проба, в которую цитратный буфер добавляют перед введеггием раствора биопразы для подавления активности фермента,При взаимодействии субтилизина с субстратом образуется п-нитроапилин, количество которого пропорциопальпо количеству активного субтилизииа, содержащегося в биопразе,Количество субтилизина определяют по калибровочной кривой, осью ординат которой служит значепие поглощения растворов пнитроаиилииа, а осью абсцисс - значение концентрации субтилизина в мкг/мл, определяемое из зависимости поглощения белка при 278 нм от его концентрации, т. е. по поглощению выделившегося и-иитроанилина при 410 нм определяют количество субтилизииа, которому соответствует это поглощепие. Предмет изобретения1. Способ определения количества щелочной протеиназы в растворе, содержащем комплекс ферментов, предусматривающий введение раствора в предварительно приготовлеи ую реакционную смесь, содержащую трисНС 1 буфер, хлористый кальций и субстрат, с последующим иикубпровапием полученной смеси и введением реагента, останавливающего протеипазный гпдролиз субстрата, отл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности и упрощения процесса определения, в качестве субстрата в реакционной смеси используют и-нитроапилид карбобензокси-глицил-глицил-У,-лейпипа, а количество протеиназы определяют по количеству выделившегося в процессе гидролиза а-нитроапилииа с последующим расчетом, папример, по калибровочной кривой.2. Способ по п. 1, отл пч а ющийся тем,что рН трис-НС 1 буфера устанавливают равным 8,5.3, Способ по п. 1, отличающийся тем,что в качестве реагента, останавливающего протеиназиый гидролиз субстрата, используют 30 2 М цитратный буфер.