Способ определения активности пектолитическихферментов

О П И С А Н И Е 204276 Союз Советскиз Социалистически РеспубликАВТОРСКОМУ СВ Зависимое от авт. свидетельстваЗаявлено 05.Х.1966 ( 1106178/28-13)с присоединением заявкиПриоритетОпубликовано 20.Х.1967. Бюллетеньа, 22/04,ч 1 ПК С 12 итет по аела изобретений и открыти при Совете бвинистров ДК 663.11:577.15.08 (088.8) ата опубликования описания 28.Х 11.19 б Авторыизобретени А. П. Рухлядева и Г. Т. КретининаВсесоюзный научно-исследовательский институт и спиртовой промышленности ерментной аявите ПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПЕКТОЛ ФЕРМЕНТОВСПО ЕСКИ КоличествоментноговораТемпература реции гидроли фер раст Известен способ определения активности пектолитических ферментов путем ферментативного гидролиза раствора пектина с последующим количественным определением расщепленного пектина.Предложено после процесса гпдролиза на гидролизат действовать сернокислым цинком, инактивируя при этом ферменты и осаждая продукты пектолиза, По количеству продуктов пектолиза, не осажденных сернокислым ци.; ком, судить о количестве расщепленного в процессе гидролиза пектина, причем это количество неосажденных продуктов определять на интерферометре по разности показателей преломления между исследуемым раствором и контрольным (эталоном).Это повышает точность определения и ускоряет процесс.Способ заключается в следующем. В пробирку наливают 20 мл 1%-ного раствора свекловичного пектина и 10 мл ферментного раствора, приготовленного на разбавителе. Содержимое пробирки перемешивают и выдерживают в термостате при 30 С в течение 1 час для проведения реакции гидролиза пектина. После этого к реакционной жидкости добавляют 2 мл 150/,-ного раствора сернокислого цинка для инактивации фермента и для осаждения макромолекулярных продуктов пектолиза. Содержимое пробирки перемешивают и фильтруют. Полученный прозрачный раствор является исследуемым. Одновременно готовят контрольный раствор. Для этого в пробирку наливают 2 лгг 15%-ного раствора сернокислого цинка, 20 игл дистиллированной воды и 10 лгл того же ферментного раствора. Содержимое пробирки перемешивают.Затем интерферометром ИТРопределяют разность показателей преломления исследуемого и контрольного растворов (Лгг), получаемую в результате наличия не осаждаемых сернокислым цинком продуктов пектолпза в исследуемом растворе.Замер Лгг производят в кювете с длиной грани 4 слг. Для получения точных результатов необходимо брать на анализ такое количество ферментного материала, чтобы Лгг= =250-:-1250. За единицу пектолитической активности принимают такое количество фермента, которое гидролизует 1 г пектина до продуктов, пе осаждаемых раствором серно- кислого цинка, грп соблюдении строго определенных следующих условий.Количество субст- - 20 лг,г 1%-ного растрата вора свекловичногопектина- 10 мл204276 3,9 - 4,1 Величина рН реакционной средыВремя гидролиза 1 часРедактор В. ф, Чулкова Заказ 4 Ю 9 Тираж 535 ПодписноеЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР Москва, Центр, пр. Серова, д. 4 Типография, пр, Сапунова, 2 Соотношение фермент-субстрат в среде,обеспечивающее гидролиз пектина на 30%. Количество .осади мл 15%-ного раствотеля ра сернокислого цин. ка, Полученное значение Кп подставляют в следую цее уравнение:О, 07585 Ь п + 12, 59ПкА=или ед/мл,и 1000 где П 1 Л, - пектолитическая активность анализируемого ферментного материала, в принятых единицах; т - количество ферментного материала, взятого на анализ в г или мл;0,07585, 12,59 и 1000 - постоянные коэффициенты, полученные по законам аналитической геометрии.Э 1 о уравнение составлено на основе изучения зависимости между разностью показателей прел:мления исследуемого и контрольного растворов и количеством единиц активности ферментного препарата, взятого для проведения ферментативной реакции.П р и м е р. Для анализа препарата фермента Азрегр 11 цз п 1 дег берут навеску его в 0,1 г и переводят ее в колбу на 50 сма, разбавителем доводят объем в колбе до метки. Перемешав содержимое колбы, берут из нее 10 мл раствора и переносят в колбу на 50 смз, доведя объем разбавителя до метки, Затем из получснного перемешанного раствора отбирают 10 мл для проведения ферментативной реакции, что соответствует содержанию ферментного препарата в количестве 4 мг.,1 осле приготовления исследуемого и контрольного растворов определяют Ла на интерферометре. Оно равно 733, Подставив это значение в уравнение, находят100,07585 733+ 12,59 17 05 Д0,004 1000 При определении активности пектолитических ферментов по описываемому способу 15 расхождение в среднем составляет +2,5%, аэго зндчпт, что способ более точен. Предмет изобретенияСпособ определения активности пектолити ческих ферментов путем ферментативного гидролиа раствора пектина с последующим количественным определением расщепленного пектина, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения и ускорения 25 процесса, после процесса гидролиза производят осаждение продуктов пектолиза и инактивацию ферментов сернокислым цинком, а количественное определение расщепленного в процессе гидролиза пектина проводят по ко.30 личеству продуктов пектолиза, не осажденных сернокислым цинком, причем это количество устанавливают на интерферометре па разности показателей преломления между исследуемым раствором и контрольным (этало ном).