Способ обнаружения вирусов

"1У ОБРЕТЕНИЯ АНИЕ И АВТО РСК ВИДЕТЕ У 8елита и вирусных энВ.И,ХаустовЮа 1 егзоп А.птЬосу Подест р, 307-338,ТЬе.Абч. О ЖЕНИЛ ВИРУСиотехнология, вружения и тести русо- роваикропомощью эле нно Изобретение гии. а именно к использовано д держащих полуф паратов. исследскопа относится к био ирусологии, и мо я тестирования абрикатов и вирус вируссосодерж яют различные иммунозлектронтехноложет быть вируссоных прео способа яел ая чувствител стщих маетоды, в ой микДля анализа а териалов примен м частности метод н роскопии (ИЭМ).Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ обнаружения вирчсов, включающий инкубацию вируссодержащей суспенэии с кроличьей специфической имунной сывороткой в течение 30 - 60 мин при 37"С с последующей инкубацией этой смеси в течение 12 - 18 ч (второй этап инкубации) при 4 С. Затем эту суспензию центрифугируют при 12000 - 15000 х 9 в течение 60 - 90 мин. Осадок ресуспендируют е 0,05-0,1 мл 1-36-ного раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты (рН 6,8-7,2) и наносят на сетку с пленкой-подложкой из формеара, укрепленной углеродом. Приготовленные препараты вышени едующим об ОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Институт полиомцефалитов АМН СССР(57) Использование: блогия, способы обна Ы 1751679 А 1 2ния вирусов. Сущность изобретения: к еируссодержащей пробе добавляют желточные антитела, которые затем обрабатывают ультразвуком с частотой 22 - 44 кГц в течение 30 - 45 с. Затем пробу инкубируют в течение 30 - 60 мин при 37 С, после чего к ней добавляют полиэтиленгликоль до конечной концентрации 1 - 3;4 и инкубируют в течение 12-18 ч при 4 С с последующим центрифугированием и электронно-микроскопическим исследованием осадка. По сравнению с известным способом чувствительность увеличивается в 10-15 раз,Недостатком известнося его относительно низость, Цель изобретения - поительности способа Способ осуществляют с В вируссодержащую суспензию, взятую О в объеме 0,8 мл, вносят желточные антитела в количестве 0,2 мл (е разведении 1:400). Желточные антитела против вируса поли- О омиалита гоПМ) валционного штамма Саби. на типа 1 изготовлены в.ИПВЭ АМН СССР, По аналогинной талнологии готовили анти- ) в тела против ротавирусов обезьян (РВ) штамма ЯА - 11 в лаборатории электронной микроскопии и патоморфологии названного института путем иммунизации кур вирусными антигенами с последующим выделением антител из желтков яиц. Титры антител пе. ред,исследованием определяют иммуно1751679 ферментным методом и отбираютпрепараты с титром не ниже 1:10 000,Формула изобретения Способ обнаружения вирусов, включающий добавление к вируссодержащей суспензии специфических антител, двух- этапную инкубацию, центрифугирование и электронно-микроскопическое исследование ресуспендированного осадка, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, из антител используют желточные антитела, перед первым этапом инкубации суспензию с антителами обрабатывают ультразвуком с частотой 22-44 кГц в течение 30-45 с, а перед вторым этапом инкубации в суспензию вносят полиэтиленгликоль в концентрации 1-3 Составитель В,ЛитовченкоТехред ММоргентал Корректор Л.Филь Редактор АЛежнина Заказ 2688Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 ПроиЗводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 После внесения в вируссодержащую суспензию (исследуемую пробу) антител ее 5 подвергают обработке ультразвуком с частотой 22-44 к Гц в течение 30 - 45 с однократно. Затем суспензию инкубируют при 37 С в течение 30-60 мин (1-й этап инкубации), добавляют к ней 50-ный раствор полиэти ленгликолч (ПЭГ) до его конечной концентрации 1 - Зо/ и повторно инкубируют при 4 С в течение 12-18 ч (2-й этап инкубации). По окончании инкубации суспензию центрифугируют при 12000-15000 хц в течение 60 - 90 15 мин, осадок ресуспендируют в 1-3-ном растворе Фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) рН 6,8-7,2 и наносят на сетку с пленкой-подложкой из Формвара, укрепленной углеродом. Приготовленный аким образом 20 препарат исследуют с помощью электронного микроскопа.П р и и е р 1. К 0,8 мл суспензии ВПМ с титром 4,О .о 9 БОЕ/мл добавляют 0,2 мл специфических желточных антител (в разве дении 1:400), Затем эту суспензию обрабатывают ультразвуком с частотой 22 кГц в течение 30 с однократно и инкубируют ее при 37 С в течение 30 мин, после чего к , суспензии добавляют ПЭГ - 6000 до его ко нечной концентрации 1 О и повторно инкубируют при 4 С в течение 18 ч, Затем суспензию центрифугируют при 12000 х 9 в течение 60 мин, а осадок ресуспендируют в 1;4-ной ФВК рй 6,8 и наносят на сетку с 35 пленкой-подложкой из формвара, укрепленной углеродом, Препарат исследуют с помощью электронного микроскопа. В исследуемой пробе было определено 10 ви- русных частиц/мл, 40П р и и е р 2., Количество вирусных частиц а суспензии, содержащей ВПМ, определяют аналогично примеру 1 з исключением того, что суспензию вируса последобавления к ней антител обрабатываютультразвуком с частотой 44 кГц в течение 45с, а после второго этапа инкубации добавляют ПЭГдо конечной концентрации 3%.В исследуемой пробе было обнаружено 10частиц/мл,П р и м е р 3. Количество вирусныхчастиц в суспензии, содержащей РВ с исходным титром 10 ТЦД 5 о/мл, определяют4как описано в примере 1, В исследуемойпробе было найдено 10вирусныхчастиц/мл,По сравнению с прототипом чувствительность предлагаемого способа обнаружения вирусов возрастает в 10-15 раз, Так,минимальная концентрация вирусных частиц, выявляемая по прототипу, в случаеВПМ составила до 10 вирусных частиц/мл.6а пои использовании предлагаемого способа - 10 вирусных частиц/мл; в случае РВобезьян соответственно по прототипу - до10 вирусных частиц/мл, а с использованиемпредлагаемого способа - до 10 вирусных .5частиц/мл,