Способ извлечения нуклеиновых кислот из геля

(21) 44703 (22) 04.08 (46) 15.11 (71) Всесо ский инст гни(72) и В. 9/30-138890. Бюл. У 42 вател ныи научно-ис кладной микробиолотут езни фрак Цель направлеюддерла ия, чт при ра выходго геля зделении, и а нуклеиновых. Свойства ы пор) опреул нуклеиногеля, следние молекул тношению к ости гелятины (0,8 вают его д разделяющ тины (малы способност тпроникат кислот геля же деляют вых кис разм олек в ется осажешней по ствием чего явл ДНК и РНК на в разделяющему г желатины. Дале 1,2 мм толщино конкретные зсн 38 С. Нуклеино желатины экстр ю поверхн лои ж вычленяют яют при 3 и расплаве кислотыкцией фенол тделяют о ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬПИПРИ ГННТ СССР И. И. Болезнин, О. Н. БоВ. Смолянинов547.963,3(088.8)Апа 1, В 1 осЬетхзгу, 197(54) СПОСОБ ИЗВЛЕЧЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХКИСЛОТ ИЗ ГЕЛЯ(57) Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, вчастности к способам вьделения иционирования нуклеиновых кислот.изобретения - повышение выхода и упрощение способа элюирования нуклеиновых кислот из гелей. Отличительнойчертой предлагаемого способа является формирование слоя геля желатиныконцентраций 5-10% параллельно краю Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к способам вьделения и фракционирования нуклеиновых кислот,Целью изобретения является увеличение выхода и упрощение способа.По окончании разделяющего электрофореэа перпендикулярно направлению электрического поля, параллельно краи разделяющего геля формируют слой геля желатины (5-107) с зазором между ними 1-1,5 мм, .заполняемым буфером. Вслед за этим к комбинированному гелю прикладывают электрическое поле того же 2разделяющего геля (полиакриламид, агароза), причем между гелями оставляют зазор, заполненный буфером, затем осаждают нуклеиновые кислоты на геле желатины, прикладывая к комбинированному гелю электрическое поле, в направлении, перпендикулярном разделяющему. После этого с поверхности геля желатины срезают слой толщиной около 1 мм, вырезают зоны, соответствующие нуклеиновым кислотам, и расплавляют их при 37-38 С, Нуклеиновые кислоты отделяют от желатины экстракцией фенолом. Выход РНК и фрагментов ДНК, размеры которых ограничиваются возможностями разделяющего гелй, составляет более 95%, Предлагаемый метод может найти широкое применение в важнейшем направлении биотехнологии - генной инженерии и различных областях молекулярной биологии, связанных с вы делением нуклеиновых кислот и их фрагментов.3 1606511 Формула и з о б р е т е н и я Составитель Н. АлександрушкинаРедактор Т. Лазоренко Техред М.Ходанйч Корректор С, Черни Заказ 3527 Тираж 298 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,01 Предложенный способ обеспечивает95 П элюцию молекул и фрагментов РНК иДНК разного молекулярного веса, втом числе и высокомолекулярных.П р и"м е р 1. В горизонтальномприборе для электрофореза параллельно краю 0,8 -ного геля агарозы размерами 60 х 10 хЗ мм, содержащего зону ДНКплазмиды рВК 322 (10 мкг), формируют 10слой 5 -ного геля желатины размерами60 х 10 хЗ мм с зазором между ними 1 мм.Зазор заполняют электрофорезным буфером. К комбинированному гелю прилагают электрическое поле напряжением10 В в течение 2 ч, После этого с поверхности геля желатины, обращеннойк агарозному гелю, срезают слой 60 хх 3 мм и толщиной около 1 мм. Фрагмент геля, содержащий плазмидную ДНКь 20помещают в центрифужную пробирку, расппавляют при 3 С в течение 5 мин иперемешивают с равным объемом фенола,насыщенного буфером. После разделенияфаз центрифугированием водную фазу 25отбирают. После удаления следов фенола измеряют выход ДНК. Он составилболее 95/.П р и м е р 2. Отличается от примера 1 тем, что из О, -ного геля ага розы (50 х 20 хЗ) указанным способомпроводят элюцию В 8111-фрагмента(1,4 т.п.н.) ДНК фага Т 4. Злюирующийэлектрофорез проводят при 10 В в течение 8 ч. Выход фрагмента ДНК более95 ,П р и м е р 3. Осуществляют аналогично примеру 1, но из комбинированного 2 .-ного полиакриламида - 0,5 Пного агарозного геля (100 х 10 хЗ) проводят элюцию РНК фага на поверхность10 П-ного геля желатины (60 х 10 хЗ). Режим элюирующего электрофореза - 20 В,4 ч. Выход РНК более 95 П.П р и м е р 4. Отличается от примера 1 тем, что из 10 П-ного полиакриламидного геля (50 х 20 хЗ) элюируют указанным способом зР 1 58 РНК Е. со 11 на поверхность 5 П-ного геля желатины (%0 х 20 хЗ). Режим электрофореза - 20 В, 6 ч, Выход 5 Б РНК, более 95 П.Таким образом, предлагаемый способ позволяет добиться гочти полного (95 П) выхода нуклеиновых кислот разного молекулярного веса из разделяющего и элюирующего гелей, дает возможность отказаться от дорогостоящей легкоплавкой.агарозы, обеспечивает стабильность нуклеиновых кислот, способных денатурировать в интервале температур 38-65 С, позволяет концентрировать нуклеотидный материал на поверхности желатины и исключает его разбавление при экстракции фЪнолом, обеспечивает возможность элюции из различных типов гелей и, наконец, получаемые элюаты не содержат примесей, ингибирующих разного рода ферментативныеактивности, в том числе зндонуклеазные.Все это позволяет широко использовать описанный подход в генной инженерии и различных молекулярно-биопогических исследований, связанных с разделением и получением нуклеиновьх кислот и их фрагментов. Способ извлечения нуклеиновых кислот из геляпредусматривающий проведение электрофореза, расплавление геля, экстракцию фенолом, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода и упрощения способа, перед электрофорезом, параллельно ,краю разделяющего геля и перпендикулярно силовым линиям электрического поля, формируют слой геля желатины концентрацией 5 - 10 П, причем месяцу гелями оставляют зазор, заполненный буфером, а расплавляют слой геля желатины, обращенный к агарозному гелю.