Способ препаративного диск-электрофореза

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик(23) Приоритет Государственный комитет СССР ио делам изобретений и открытий(54) СПОСОБ ПРЕПАРА.сИВНОГО ДИСК-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА 5 10 15 20 25 30 Изобретение относится к области биохимии и предназначено для разделения белков, нуклеиновых кислот, углеводов и других биополимеров, имеющих заряд.Известный способ препаративного диск-электрофореза в полиакриламидном геле состоит в том, что через край разделяющего полиакриламидного геля, удаленный от концентрирующего полиакриламидного геля, непрерывно в течение всего времени проведения электрофореза пропускают буферный раствор, в который попадают разреленные компоненты по мере их выхода из геля, после прохождения через край разделяющего геля буферный раствор собирают с помощью коллектора равными Фракциями в пробирки 1 .Однако известный способ препаративного диск-электрофореза не позволяет получить качественного разделения компонентов, поскольку при алюции и сборе по Фракциям последних в процессе электрофореза нельзя точно согласовать производительность ряда приборов (как минимум, микронасоса., электрофоретической камеры и комплектора фракций, объединенных в единый комплекс), зависящую, в свою 2очередь, от условий проведения электрофореза, Компоненты получаются слишком разведенными или же элюируются не полностью.Наиболее близким к предложенному способу является способ препаративного диск-электрофореза, при котором в вертикальной колонке на гидростатическую пробку наносят слой концентрирующего голиакриламидного геля, со смесью исследуемых компонентов, на который затем наносят слой разделяющего геля и электродный буфер, проводят электрофорез и собирают фракции разделенных компонентов 2 .Однако и этот способ препаративного диск-электрофореза не обеспечивает качества разделения компонентов в связи с тем, что разделенные в полиакриламидном геле компоненты в процессе элюции буферным раствором в зависимости от скорости протекания последнего разбавляются или полностью не элюируются.Целью изобретения является повышение качества разделения компонентов.Для достижения этой цели перед нанесением электродного буфера на слой разделяющего геля наслаивают столб жидкости с градиентом плотностиФормула изобретения 30 сахарозы и таким же буфером, как в разделяющем геле.На чертеже приведена схема предлагаемого препаративного диск-электрофореза.В электрофоретическую камеру, представляющую собой вертикальную колонку 1, на гидростатическую пробку 2 из полиакриламидного гелясодержащую электродный буфер, наносят слой 3 концентрирующего геля, полиакриламидного или сафадекса, содержащего исследующую смесь компонентов, например белков, и концентрирующий буфер. На концентрирующий полиакриламидный гель наносят разделяющий полиакриламидный гель 4, включающий в себя разделяющий буфер и сахарозу, над поверхностью которого затем создают столб 5 жидкости с градиентом плотности сахарозы, также содержащий разделяющий буфер, Наибольшая концентрация сахарозы в столбе жидкости равна или несколько меньше, чем ее концентрация в разделяющем геле, Поверх этого столба жидкости наслаивают .электродный буфер б не содержащий сахарозы. После проведения электрофореэа жидкость с градиентом плотности сахаровы, в которую перешли из геля разделенные компоненты исследуемых веществ, собирают по фракциям. Принцип работы предлагаемогоустройства состоит в том, что в электрофоретическую камеру, представляющуюсобой вертикальную колонку, вносятс концентрирующим гелем (полиакриламидным или сефадексом) исследуемыебелки или другие биополимеры, имеющиезаряд,Поверх концентрирующего геля наслаивают разделяющий гель, между поверхностью которого и верхним электродным буфером создают столб жидкостистабилизированной от перемешивания градиентом плотности сахарозы. Впроцессе электрофореза белки и другиебиополимеры, имеющие заряд, двигаясьвверх по колонке, концентрируются иразделяются в соответствующих гелях,а затем переходят в жидкость с градиентом плотности сахаровы и разделяющим буфером, где продолжают двигаться и разделяться. Таким образом, в предлагаемом способе препаративного диск-электрофореза разделение вначале происходит вполиакриламидном геле, а затем продолжается в жидком зональном носителе,стабилизированном от перемешиванияградиентом плотности сахаровы.Сконцентрированные и разделенные биополимеры, попадая из полиакриламидногогеля в жидкость с градиентом плотностисахаровы, при соответствующих условияхпроведения электрофореза сохраняютустойчивость, существенно не уширяясьи не седиментируя. Последнее обусловленно тем, что движение заряженныхбиополимеров происходит снизу вверх,т.е. из области с большей концентрацией сахаровы в меньшую. Величина предельной загрузки белком в предлагаемом способе находится в прямой зависимости от величины градиента плотности сахарозы в столбе жидкости. Предлагаемый способ препаративного дискэлектрофореза может найти широкоеприменение в лабораторной практикепри анализе белков, нуклеиновых кис лот, углеводов и других биополимеров,имеющих заряд, так как.он являетсяпростым и повышает качество разделения. Способ препаративного диск-электрофореза, при котором в вертикальной колонке на гидростатическую пробку наносят слой концентрирующего по 35 лиакриламидного геля со смесью исследуемых компонентов, на который затемнаносят слой разделяющего геляи электродный буфер, проводят электрофорез и собирают фракции разделенных компонентов, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения качестваразделения, перед нанесениемэлектродного буфера на слой разделяющего геля наслаивают столб жид 4 кости с градиентом плотности сахарозы и с таким же буфером, как в разделяющем геле.Источники информации,принятые во внимание при экспертиз.1. Маурер Г. Диск-электрофорез,М., Мирф, 1971, с. 141.2. Рцгбопд С.М. е 1 а Апа 1 уО.са 1Вь.осйелдзгу, 1973, 5, р. 297 (прототип) .Соста Текле витель Э, Скорняковд Э,ЧУжик Корректор Е. ПТира 1 к 1073ПодписноеИ ГосударствеНного комитета СССРделам изобретений и открытийосква ЖРаушская наб. д. 4/5 едактор И. Шубин Заказ 6919/31 п035 с с сФилиал ППП фПатент, г. Ужгород, ул. Проектная,4