Способ получения иммобилизованных нуклеиновых кислот

"АН 1 п 1- ой пис 1 е 1 в дчагей роЙз,Кев"03. носится к биологиастности к способамов для аффинной хроет,быть использовабелков, обладающихдством к нуклеиноИзобретение о ческой химии, в ч получения сорбен матографии, и мож но при выделении биологическим сро вым кислотам,Цел генера личить Из о иммобилСН-агар (при со ляет пот ром нукл и ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗО АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(56) Реопдап И. Б. ей а 1аасйешеп оЕ пис 1 е 1.з аапагозе аког аНдпгу сЬг10, р.424-42,1971РоСога 1 с Н., Пеап Р. О,гу ас 1 зогЬепз сопвдвгхп 8асдйз,пппюЬ 111 гед тра ас1 узассагЫев", Ъпс 1. Ас1978, 5, М 1, р. 297 - 3 изобретения - обеспечение реции сорбента, позволяющей увекратность его использования. ретение заключается в том, что изация нуклеиновых кислот наозе с помощью этидиумбромида отношении 100:1 " 145 п 1) позво-учить. такой сорбент, в котоеиновая кислота связана с й обратимо. Обратимость связы-.(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИИИОБИЛИЗОВАННЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, заключающийся в связывании нуклеиновойкислоты с активированной агарозойотмывании несвязавшейся нуклеиновойкислоты и использовании комплексануклеиновой кислоты с агарозой в качестве аффинного сорбента, о т л и -ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюобеспечения регенерации сорбента,позволяющей увеличить. кратность егоиспользования, проводят связываниенуклеиновой кислоты с СН-агарозой спомощью этидиумбромида при соотношении этидиумбромида с СН-агарозыот 1; 100 до 1: 145. вания достигается как использованием этидиумбромида, так и подбором опреде-ленных соотношений этидиумбромида и фр СН-агарозыувеличение этого соотно- в р шения до 1: 150 приводит к уменьшению прочности связывания нуклеиновой кислоты с матрицей, что вызывает элюцию нуклеиновой кислоты и ухудшение.свойств сорбента. Высокие концентрации этидиумбромида (соотношение 1:50) позволяют эффективно провести иммо- ф билизацию. Однако высокая прочность образующегося комплекса затрудняетпроцесс регенерации сорбента, Таким образом, использование обратимогоспособа иммобилизации нуклеиновыхкислот в сочетании с подбором оптимальных соотношений этидиумбромид:3 12301СН-агароза (1; 100 - 1; 145) позволяетобеспечить эффективную и многократную регенерацию сорбента. Проведение10, циклов регенерации не приводитк уменьшению эффективности иммоби 5лизации нуклеиновой кислоты. Так какбез регенерации сорбент может бытьиспользован 5-6 раз для выделенияферментов, то за счет его регенерации кратность использования возрастает в 10 раз до 50-60 раз. Положительный эффект заключается в том, чтопри использовании предложенного способа получения иммобилизованных нуклеиновых кислот становится возможной,простая и эффективная регенерацияцелевого продуктав процессе которой заменяется только нуклеиноваякислота, а матрица со связанным носи телем остается неизменной.Способ иллюстрируется следующимипримерами.П .р и м е р 1, Стадия А. Приготовление этидиумбромидагарозы. 253 г СН-агарозы (Олайнский химический завод) суспендируют в 10 лдистиллированной воды рН 4-6,0. К.суспензии добавляют 13,3 мл этидиум бромида, растворенного в 10 мл дистиллированной воды. Отношение этиди,умбромид; СН-агарозы равно 1;100.К полученному раствору при постоянном перемешивании добавляют циклогексил - 3-(2-морфоаминоэтил)-кар 35бодиимид мето-п-толуолсульфонат доконечной концентрации О, 1 И, поддерживая рН раствора в пределах 4,5-6,0в течение 1 ч .при комнатной температу.ре. При постоянном перемешивании 40смесь выдерживают при комнатной тем"пературе в течение 24 ч. Полученныйсорбент отмывают 1 М раствором Нас 1и этанолом до отрицательной реакциина этидиумбромид, определяемой поУФ-поглощению.Стадия Б. Иммобилизация РНК наэтидиумбромидагарозе,Этидиумбромидагарозу помещают вхроматографическую колонку и пропускают через нее раствор дрожжевойРНК в 30 мИ калий-фосфатном буферерН 7,0 с 2,5 М ИаС 1 до появленияоптической плотности. Отмывают сорбент 3 объемами этого же буфера, но 55без БаС 1. Затем сорбент промывают10 Мм калий-фосфатным буфером рН 8, 0 .с 2 мИ дитиотреитола (ДТТ), 0,2 нонидет Р, 10 глицерина. Емкость 87 4приготовленной таким образом колонки.составляет 55 мг РНК на 1 г этидиумбромидагарозы.Стадия В. Регенерация этидиумбромидагарозы (проводится через 5-6выделений фермента).Через колонку с иммобилизованнойнуклеиновой кислотой пропускают О, 1 Мраствор НаОН (3 объема), затем немедленно промывают дистиллированной водой или нейтральным буфером. Послеэтого колонка готова к новой иммобилизации. Колонку можно подвергатьдлительному хранению и многократнойрегенерации (10 раз) без изменениясвойств сорбента. Сорбент используютдля выделения РНК-.зависимой ДНК-поли-,меразы (ревертазы).130 мг вируса птичьего миелобластоза суспендируют в 6 мл 10 мМ калийфбсфатного буфера, рН 8, 0 с 2 мМ дитиотреитола О,2 . нонидет Р, 10 глицерина. К суспензии вируса последовательно добавляют при постоянномперемешивании 0,6 мл нонидет Р,0,6 мл 10 дезоксихолата натрия,1,8 мл 4 М раствора КС 1, Смесь выдер,живают при 0 С в течение 15 мин, разводят в 10 раз исходным буфером инаносят со скоростью 15 мл/ч на колонку с этидиумбромид РНК-агарозой,уравновешенную в том же буфере. Котлонку промывают; 50 мл исходного буфера и элюируют фермент линейнымградиентом КСВ от 10 до 2500 мМ. Заединицу активности принимают включение 1 нИ тимидинмонофосфата(Н ТИФ)в кислотонерастворимый продукт при37 ОС в течение 10 мин, Выход фермента по активности 85Общее количество фермента 4500 единиц (по Спигельману).1П р и м е р 2. Стадия А проводится так же, как в примере 1.Стадия Б. Иммобилизация РКН наэтидиумбромидагарозе,Этидиумбромидагарозу помещают вхроматографическую колонку и пропускают через нее раствор дрожжевойРНК в 20 мИ калий-фосфатном буферерН 9,0 с 2,5 М Нас 1 до появления оптической плотности, Отмывают сорбент3 объемами этого же буфера, но безБаС 1 Затем сорбент промывают 10 мМкалий-фосфатным буфером рН 8, 0 с2 мМ дитиотреитола, 0,2 нонидетР, 10 глицерина. Емкость приготовленной таким образом колонки сосСоставитель В.МуронецТехред М.Дидык Корректор .Л.Бескид Редактор О.Волкова Заказ 4719 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 б 1230187 6 тавляет 60 мг РНК на 1 г этидиумбро- Зтидиумбромидагарозу, приготовленмидагарозы. ную так, как описано в примере 1, поСтадия В. Регенерация этидиумбро- . мещают в хроматографическую колонку щщагарозы (проводится также, как в и пропускают через нее раствор ДНК примере 1). Эффективность иммобили 5из тимуса теленка в 30 мМ калий-Фосзации РНК не снижается после 10 цик- фатном буфере рН 9,0 с 2,5 М ИаС 1 лов регенерации. до появления пика оптической плсгности. Отмывают сорбент 3 объемами тогоП р и м е р 3. Иммобилизация ДНК 10 же буфера, но без ИаС 1. Емкость полуна этидиумбромидагарозе. ченного сорбента составляет 64 мг наЭтидиумбромидагарозу, приготов г этидиумбромидагарозы. Регенерация ленную так, как описано в примере 1, колонки с иммобилизованной ДНК прово - помещают в хроматографическую колонку дится, как описано в примере 1. и пропускают через нее раствор ДНК 15 П р и м е р 5. Стадия А. Приготовиз тимуса теленкав 30 мМ калий- ление этидиумбромидагарозы. Фосфатном буфере рН 7 с 2,5 М ИаС 1 до 3 г СН-агарозы (Олайнский х:мипоявления пика оптической плотности. ческий завод) суспендируют в 10 мп Отмывают сорбент 3 объемами того же дистиллированной воды рН 4,0 - 6,0. бУФера, но без НаС 1Емкость получен К суспензии добавляют 19,3 мг этидиумного сорбента составляет 62 мг ДНК , бромида, растворенного в 10 мл дисна 1 этидиумбромидагарозы. тиллированной воды, и далее по приП р и м е р 4. Иммобилизация ДНК Меру 1. Соотношение этидиумбромида на этидиумбромидагарозе, к матрице 1:145.