Способ трансформации возбудителя чумы

СОЮЗ СОВЕТСНИСОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИРЕСПУ БЛИН(51 15 63 ИДЕТЕЛЬСТВ К АВТОРСКОМ ледовательт "Микроб"ппов пегь.с апас 1 егегУегяь.п 1 а е. 1983,1 а и м пидеаао Цель изобсоба. В качеств тен прощение споигенетикоторогв,получ ского марк ведется от ших плазм а,РУ по выражению трансформант ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГННТ СССР(56) Роггпоу П.А. ег а 1. Се1 уягя оГ еяяепгга 1 р 1 аяппйпппапя оГ раг 11 оеп 1 г.гсу 1 преяг 1 я. в ,1. 1 пГесС. П.яеаяч. 148, Р 2, р. 297-304.Можаров О.Т. и др. Котрансфоция как метод, облегчающий иденцию собственных плазмид чумногороба. - Природная очаговость имиология особо опасных инфекцийратов, 1983, с, 92-94Изобретение относится к микробиологии, в частности к генетике возбудителя чумы, и может быть использова но для моделирования вирулентности чумного микроба с целью исследования роли плазмидных и хромосомных факторов в развитии инфекционного процесса при чуме и, следовательно, для выяснения генетических основ патоген ности и иммуногенности возбудителя чумы,(54) СПОСОБ ТРАНСФОРМАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯг 1 УМЫ(57) Изобретение отнологии, в частности кдителя чумы, Целью изется упрощение способчается в том, что содмиду рСас 1 трансформансущего хромосомальныеи Рябая (пигментсорбциность к пестицину созаражают биопробное ждующим отбором клонов по признакувирулентности. сится к микробио генетике возбуобретения явля- а. Способ заклю ержащими плазтами штамма, не- признаки Ряш я ц чувствительответственно), ивотное с послерСад,используют вирулентность возбудителя чумы. Плазмида рСай не облад ет удобным селектируемым маркером, но детерминирует синтез ряда факторов вирулентности (признак кальцийз висимости, синтез ч-антигена и терм индуцибельных белков внешней мембраны), которые в сочетании с хромосомяными признаками Ряш и Ряг придают клеткам способность вызывать летальный инфекционный процесс. Поэтому совмещение этих признаков в одной клетке придает ей вирулентные свойства и, следовательно, позволяет отб рать трансформанты, получившие рСай в организме чувствительного биопробСоставитель С,БандринТехред М.Дидык - Корректор С,йекмар Редактор И.Дербак Заказ 3032 Тираж 493 ПодписноеВНИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Иасква, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "11 атент, г.ужгород, ул . Гагарина, 101 П р и м е р. ДНК нативной плазмиды рСай (47 Мй) выделяют из моноплазмидного штамма ультрацептрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия. Лвирулецтный бесплазмидный штамм 10 возбудителя чумы, несущий хромосомцые маркеры Ррп и РзТвыращивают на3агаре Хоттингера (рН ,2) в течение 18-24 ч прц 28 С. Клетки дважды отмывают холодной дистиллированной водой и ресуспендируют в 0,1 -ной пептоцной воде. Гзвесь клеток смешивают с препаратом ДНК так что 1 мкг плазмидной ДНК приходится на 110 клеток реципиента, и подвергают процедуре криотрацсформации путем замораживация при -195 С в течение 5 мин и оттаивания при 42 С в течение 2 10 мин. Смесь разбавляют равным объемом бульона Хоттицгера или 1 Л (рН 7,2) и инкубируют в течение 1 ч при 28 С. Затем трансформационную смесь в объеме 0,2-0,5 мп вводят подкожно или внутрибрюшинно белым мышам или морским свинкам. После гибели биопробного животного, которая обычно наступает на 3-5 сут после заражения, производят вскрытие и прямой посев органов методом отпечатков на агар Хоттингера (рН 712), содержащий генцианвио 35 лет в конечном разведении 1:200000 в качестве ицгибитора посторонней микрофлоры. Культура возбудителя чумы, выде ленная из органов павшей биопробы, в 100% случаев представляет собой культуру трансформантов, получивших плазмиду рСас 1. Таким образом, преимуществом предлагаемого способа трансформации возбудителя чумы плазмидцой рСад является повышение эффективности получения трацсформантов, несущих плазмиду рСас 1, с 1,2-3,0 до 100 , Кроме того, предлагаемый способ проще известного за счет исключения ряда этапов, связанных с выделением и использованием ДНК вспомогательной плазмиды, приготовлением селективных искусственных питательных сред, содержащих антибиотики, повторным отбором трацсформантов, определением у них наследования неселектируемых фенотипических признаков плазмиды рСас 1 и излечиванием от вспомогательной плазмиды. Следовательно, предлагаемый способ позволяет экономить питательные среды, химреактивы и антибиотики. Кроме того, снижается биологическая опасность для окружающей среды трансформантов возбудителя чумы, не обладающих устойчивостью к антибиотикам.Формула изобретения Способ трансформации возбудителя чумы, включающий выделение плазмидцой ДНК кальцийзависимости введение плазмидной ДНК в клетки реципиентного штамма в условиях замораживания-оттаивания, культивирование и отбор трансформантов, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения способа, в качестве реципиентного штамма используют авирулентный штамм Уегзпха резз, несущий признак пигментсорбции Ррах+и чувствительность к пестицину Рзз, в качестве плазмидной ДНК - плазмиду рСай, культивирование осуществляют в организме биопробного животного, а отбор трансформантов проводят по признаку вирулентцости.