Способ выделения сайт-специфической эндонуклеазы cla i

(51)4 С 1 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ к 48 ноте дназантных рук выходзы ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(22) 02.01.85 (46) 30.01;88. Бюл. У 4 (71) Всесоюзный научно-исследо тельский институт прикладной м биологии (72) В.М.Крамаров, В.В.Мочалов и В.В.Смолянинов (53) 575.113(088.8) (56) Мауег Н. еС а 1 , 1981, Бц АсЫз Вез, Ч. 9, Р 19, р. 4833 (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ САИТ-СПЕЧЕСКОИ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ С 1 а 1 (57) Изобретение относится к бнологии, а именно к получению специфических эндонуклеаз, преначенных для создания рекомбинмолекул ДНК, анализа первичной туры ДНК, создания банков геноЦель изобретения - увеличениесайт-специфической эндонуклеа С 1 а 1 и повышение степени очисткиее от примесей. Для этого готовят носитель с иммобилизованным цибарконовым синим Р 3 ОА. Затем выделяют эндонуклеазу С 1 а 1. Бесклеточный экстракт С, 1 аСюп О, содержащий зндонуклеазу С 1 а 1 Ы наносят на колонку,содержащую носитель с иммобилизованным красителем РЗОА. Колонку промывают 1 О мМ калий-фосфатным буфером,содержащим 0,1 М ИаС 1 до нулевогооптического поглощения при 280 нм.Затем элюируют белки. ЭндонуклеазаС 1 а 1 элюирует при концентрации ИаС 10,5-0,8 М. Фракции, содержащие фер"мент, объединяют, диализуют 6-10 чпротив буфера, содержащего 507. глицерин, хранят при -20 С. В полученномпрепарате определяют активность С 1 а 1содержание белка и нуклеиновых ки"слот. 1 табл.1306127 при -20 С. В полученном препарате определяют активность С 1 а 1, содержание белка и нуклеиновых кислот.П р и м е р. Определение оптимального содержания иммобилиэованного красителя,Бесклеточный экстракт, содержащий СХа 1, наносят на колонки с различным содержанием красителя РЗОА и проводят выделение Фермента. Зависимость выхода С 1 а 1 (на 1 г биомассы) от количества иммобилизованного красителя дана в таблице. Изобретение относится к областибиотехнологии, в частности к получению сайт-специфических зндонуклеаз,предназначенных для создания реком 5бинантных молекул ДНК, анализа первичной структуры ДНК, создания банков генов.Целью изобретения является увеличение выхода сайт-специфической эндонуклеазы С 1 а, 1 и повышение степениочистки ее от примесей,Способ осуществляют следующим образом.Приготовление носителя с иммобилизованным цибакроновым синим УЗСА.20 мл сефарозы С 1 4 В суспендируют в30 мл НО, добавляют 110 мг красителя УЗЛА, затем раствор 4 М 11 аСХ доконечной концентрации 0,4 М, объемпри этом доводят до 45 мл, После20 мин механического перемешиваниясмеси добавляют 0,2 мл 5 М ИаОН иинкубируют при 62 С. Проверяют количество иммобилизованного красителяпо уменьшению оптического поглощениянадосадочной жидкости при 610 нм,После завершения реакции несвязавшийся краситель отмывают на стеклянномфильтре дистиллированной водой до исчезновения синей окраски в промывныхводах.Выделение эндонуклеазы С 1 а 1,Бесклеточный экстракт С. Ха 1 лп С,содержащий эндонуклеазу СХа 1, Ь, наносят на колонку, содержащую носитель 35с иммобилизованным красителем УЗЛА,Колонку промывают 10 мМ калийфосфатным буфером, содержащим 0,1 М ЬаС 1до нулевого оптического поглощенияпри 280 нм и затем элюируют белки лил 0нейным градиентом 0,1-1 М МаСХ в1 О мМ калий"фосфатном буфере, Эндону.клеаза СХа 1 элюирует в области концентрацией ИаС 1 0,5-0,8 М,Фракции,содержащие фермент, объединяют, диализируют 6-10 ч против буфера, содержащего 50 Е глицерина, и хранят Количество Активность р едМолярность,при которойэлюируетсяФермент красителяна 1 мл носителямкмоль 0,9 5000 1,6 5000 2,5 2000 Более 3 500 0,5-0,7 0,5-0,8 0,8-1,5 Более 1,5 Формула изобретения Способ выделения сайт-специфической эндонуклеазы С 1 а 1, включающий получение бесклеточного экстракта С. Хам. Ь хроматографию его с последующей элюцией целевого продукта раствором хлористого натрия, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения степени чистоты и уцельной активности делевого продукта, хроматографию экстракта осуществляют на сорбенте с иммобилизованным лигандом цибакроновым синим РЗСА при содержании лиганда 0,9- 2,0 мкмоль/мл сорбента, а элюцию проводят в градиенте концентрации хпористого натрия. Составитель А,МакаровТехРед М,Коданич Корректор Л, Патай Редактор А.Купрякова Заказ 739 Тираж 520 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, .Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4