Способ получения иммуносорбента

(5 ВСЕ; 1 Ц(Ц 1 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ВУ ногоогии ио акад Гурви еых тиове ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ ВТОРСНОМУ СВИ ЕТ(71) Ордена Трудового КраЗнамени институт эпидемиолмикробиологии им. почетнока Н.Ф. Гамалеи(56) Лехтцинд Е.В, Синтезпов иммуносорбентов на оснлозы. /Канд.дис. -М.: 1982с. 125-12980122920(54)(57)СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСОР, БЕНТА, включающий обработку пористых целлюлозньцс шариков метапериодатом натрия, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения ем кости иммуносорбента, дополнительно проводят последовательную обработку избытком 1,5-диаминопентана и Б-ац тилгомоцистеинтиолактона в карбонат но-бикарбонатном буфере и избытком 5,5-дитиоЫас (2-нитробензойной кис(лоты) и ГаЬ зфрагментов антител в тос =НС 0 буфере.12292Изобретение относится к медицине и биотехнологии, а именно к способу получения высокоемкого иммуцосорбента для специфического связьгвания антигена.Иммуносорбенты, прецставляющиенерастворимую основу, к которой ковалентной связью присоединяют антитела, нашли широкое применение дляспецифического выделения как корпускулярных, так и молекулярньгк антигенов (клетки, вирусы, белки, полисахариды, биологически активные пептиды и др.).Цель изобретения - повышение емкости иммуносорбента,П р и м е р 1. К 300 мг пористыхцеллюлозных шариков (ПЦШ) добавляютЗО мл 0,1 М Ба 10. Реакционную смесьпериодически перемешивают в течение30 мин при комнатной температуре втемноте, В результате образуютсяальдегидные группы, ПЦШ отмывают500 мл Н 0 на стеклянном фильтре ио,хранят при 4 С. Количество альдегидных групп практически це снижаетсяпо крайней мере в течение двух лет.300 кг альдегидного производногоПЦШ промывают на стеклянном Фильтре50 мл 0,1 М карбонатно-бикарбонатного буфера рН 9,5 и добавляют 1,5-диаминопентан в избытке до конечнойконцентрации 0,02 М в объеме 25 мл.Реакцию проводят в течение 1 ч прикомнатной температуре, В конце реакции непрореагировавшие альдегидные группы, а также Шиффовы основания восстанавливают 100 мл 0,27.Х 4 аВН в 0,1 М ЛаНСОд,300 мг ПЦШ промывают 50 мл 0,1 Мкарбонатно-бикарбонатцого буферарН 10,6 с 0,00 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и добавляют Е-ацетилгомоцистеинтиолактоц в избыткедо конечной концентрации 0,015 М вобъеме 15 мл. Реакцию проводят 2,5при комнатной температуре, Полученноетиолпроизводное ПЦШ промывают 100 млО, М трос - НСг буфером рН 8,0 с0,001 М этилендиаминтетрауксуснойкислоты и добавляют 1 О мл 0,001 М5,5-дитио-йс( 2-нитробецзойной кислоты) в избытке в том же буфере. Реакцию проводят в темноте 30 мин прикомнатной температуре, Полученноепроизводное ПЦШ отмывают тем же буфером, 0,5 М БаС 1, буфером и хранятпри 4 С. 1 гаЬ -фрагменты получают из 04 2 чистых антител осла против 1 дО кроликлП р и м е р 2, Для получения иммуцосорбента берут 3 мг и 1 мг ГаЬфрагментов в избытке в 0,1 М трос -НС 1 буфера рН 8,0 с 0,3 М 11 аС 1 и0,00 М этилендиаминтетрауксуснойкислоты и при комнатной температурепропускают отдельно через две колонки 0,6 х 14 см), содержащие по12 мг конечного продукта ПЦШ, Вышед ший белок пропускают через колонкиеще два раза. ПЦШ отмывают тем жебуфером и определяют количество связавшегося белка. К ПЦШ в колонкахв данных условиях присоединяется12 мг и 0,57 мг 1"аЬ -фрагментов соо тле гтзенцоЕмкость и специфичность полученных иммуцосорбецтов иллюстрируетсяследующим г;римером.П р и м е р .3. Через колонки с1 НШ 1, содержащие 1,2 мг и 0,57 мгга, -Фрагментов, пропускают 1 мл и0,55 мл нормальной сыворотки кролика. Колонки отмывают 0 5 М БаС 1 рН7,0 до исчезновения белка в промывцсм растворе, Присоединившийся материал элюируют 0,0 ПС 1 с 05 МГаС. и нейтрализуют добавлением сухого .аНСЛ. Результаты иммунодифФузиоццого анализа элюировацногоматериала указывают на специфичностьсинтезированного иммуносорбецта.Количество элюированного антигенаг ьроггика с колонок соответственцо составляет 2,24 мг и 1,5 мг, чтосоответствует емкости 187 мг/г и15 мг/г иммуцосорбецта, Однако молярцые соотношения элюировяннОГО/1ацтигеца ,3 -;, кроликаи аЬ -фрагментов ца иммуносорбецтах различают. -сц ,0,69 и 0,96 т,е, в случаеменьшего содержания РгЬ -фрагментовца 1 НШ с ацтигецом реагирует каждыйктцвцый центр га, Это объясняется тем что большее количество ГаЬца ПЦП создает более плотное расположение их ца ППШ, что приводит кстерическим препятствиям для реакции с антигоном,При использовании ПЦШ с присоединенными цельными молекулами антител емкость составляет 50-60 мг/гпримерно в три раза меньше чем впримере 3 а соо гцошецие антигец/активный центр антитела гораздо ниже О,:),