Способ получения лактатдегидрогеназы

/теЩл,ОПИСА Е ИЗОБРЕТЕНИЯ р 11 438683 Союз СоветскихСоциалистическимиРеспубпии К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ависимое от авт. свидетельства(51) М, Кл. С 120 13/10 22) Заявлено 07.06.72 (21) 1810035/28-13 рисоединением явки Ме Государствеииый комитет Совета Мииистрав СССР ло делам изооретенит и открытий(53) УДК 5 7.15,0888,8) А. М. Ирген и А, ф, Лидерефилиал Всесоюзного научно-исследователь ских реактивов и особо чистых химическис ИРЕА оговещест ОСОБ ПОЛУЧЕ Изобретение относится к микробиологической промышленности, точнее к способу получения лактатдегидрогеназы, применяемой вобласти биохимии для исследовательских работ, а также в медицине для определения молочной и пировиноградной кислот.Известен способ получения лактатдегидрогеназы путем культивирования Езс 1 тегсЫасо 11 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли 10при рН 7,2 в аэробных условиях с последующим отделением биомассы и выделением изнее фермента.Предлагаемый способ повышает выход иактивность фермента,15Достигается это тем, что из Езс 1 тегсЫасо 11 используют штамм ВКМв, а в качестве источника углерода и азота применяютдрожжевой и мясной экстракты.Целесообразно использовать дрожжевой и 20мясной экстракты в соотношении 1: 1, а изсолей - хлористый натрий, хлористый магний, двузамещенный фосфорнокислый натрий,однозамещенный фосфорнокислый калий,сернокислый аммоний, хлористый аммоний в 25количествах соответственно равных, в г;1 0,0; 0,2; 12,5; 5,0; 0,5; 0,5.Культивирование осуществляют при тратуре 28 - 32 С, Лактатдегидрогеназучают путем культивирования Езс 1 тегсЫ 30 емпе- полуа со 11А КТАТДЕГИДРОГЕНАЗЬ на питательной среде с добавками дрожжевого и мясного экстрактов в соотношении 1: 1, служащих добавочными источниками азота, фосфора и углерода, а также стимуляторами роста. Из Езс 1 тегсЫа со 11 используют штамм ВКМв, обеспечивающий высокую активность фермента, значительный выход биомассы с длительной сохранностью препарата. Оптимальная концентрация источника углерода в среде 0,6 - 0,8% глюкозы, рН среды (7,2) устанавливают путем добавления 10%-ного ИаеНР 04. В среду стерильно добавляют инокулят из однородных клеток с количеством сухих веществ 1 мл/мл среды мясопептонного бульона.Инокулят добавляют с расчетом 10 мл клеточной суспензии на литр питательной среды, что составляет количество сухих веществ 0,01 мг/мл среды, культивирование осуществляют при температуре 28 - 32 С в аэробных условиях в течение 12 - 18 час. Концентрация клеток достигает 10 - 12 10 клеток (в мл), После ферментации биомассу подвергают отцентрифугированию и дезинтеграции ультразвуком или механической обработке с последующей лиофилизацией или обработкой ацетоном. Для определения активности лактатдегидрогеназы используют метод феррицианида, белок определяют по методу Лоури.3Штамм ЕзсйегсЫа со 11 ВКМвполучен из коллекции музейных культур Института микробиологии АН СССР в 1966 г. и имеет следующую характеристику.М о р ф о л о г и я: имеет форму палочек с размерами 2,7 К 5,2, грамотрицательный, спор не образует.Физиолого-биохимические свойс т в а: желатин не разжижает, культура растет на синтетических средах, преимущественно использует аммонийный азот, а также на средах с пептоном, с дрожжевым автолизатом, с гидролизатом казеина, свободный азот не фиксирует.Углеродное питание штамма характеризуется сбраживанием моно-, ди-, полисахаридов, спиртов и органических кислот. Из последних слабо использует фумаровую и виннокаменную кислоты, не использует лимонную, яблочную кислоты.Продукты обмена штамма: образование аммиака, сероводорода, индола, восстановление нитратов до нитритов.Культура растет при рН 5 - 9, оптимум рН роста 6 - 7, температуре 30 - 37 С, имеет дезаминирующие и декарбоксилирующие способности.Пример 1.Состав основной питательной среды (на 1 л среды).Раствор А:Мясной бульон, мл 50 Дрожжевой автолизат, мл 50 Хлористый натрий, г 10 Хлористый магний, г 0,2 Двузамещенный фосфорнокислый натрий, г 12,5Однозамещенный фосфорнокислый калий, г 5,0Сернокислый аммоний, г 0,5 Хлористый аммоний, г 0,5 Диминерализованная вода, л 0,9Раствор стерилизуют при 110 С 30 мин,Раствор Б:0,6% -ный водный раствор глюкозы стерилизуют при 55 С (0,5 атм.) 30 мин.Затем проводят выращивание микробиальной биомассы ЕзсйегсЫа со 11 ВКМв,1) подмолаживание культуры - культура ЕзсйегсЫа со 11 ВКМвподдерживается на косяках МПА, пересевается приблизительно раз в месяц. Для инокуляции используют культуру 16-часового выращивания на косом агаре. Культуру пересевают в колбу с 100 мл МПБ на 6 час при температуре 30 С на качалках при 100 об/мин. Однородность культуры проверяют микроскопированием и посевом на чашки Петри с МПА (мясопептонным агаром). Таким образом приготовленный посевной материал используют для инокуляции ферментаций в больших емкостях,2) Ферментация культуры ЕзсйегсЫа со 11 ВКМв. Питательную среду помещают в438683 ферментатор ЕМи при помощи 10 О/о-ного ХаНРО 4 устанавливают рН среды на 7,2.Стерильно добавляют инокулят из однородных клеток. Инокулят добавляют с расчетом 5 10 мл клеточной суспензии в МПБ на литрпитательной среды, что составляет количество сухих веществ клеток в 0,1 мг на 1 мл среды. Ферментация культуры ЕзсЬегсЫа со 11 ВКМвпроизводят при 30 С с аэрацией 10 около 12 час, Значительные отклонения отданных инокулята влияют на развитие культуры и длительность ферментации, ускоряя или замедляя этот процесс.Пример 2.15 Приготовление питательной среды для глубинной ферментации культуры (на 1 л среды): Раствор А:Мясной бульон, мл 50Дрожжевой экстракт, г 2,5Хлористый натрий, г 10,0Хлористый магний, г 0,2Двузамещенный фосфорнокислый натрий, г 12,5Однозамещенный фосфорнокислый калий, гСернокислый аммоний, гХлористый аммоний, гДеминерализованная вода, л 30 Стерилизация при 110 С 30 мин.Раствор Б:0,8%-ный водный раствор глюкозы стерилизуется при 55 С (0,5 атм.) 30 мин.Микробиальную биомассу выращивают 35 также, как и в примере 1. 20 5,00,50,50,95 Предмет изобретения 40 1. Способ получения лактатдегидрогеназыпутем культивирования ЕзспегсЫа со 11 напитательной среде, содержащей источникиуглерода, азота и минеральные соли прирН 7,2 в аэробных условиях с последующим45 отделением биомассы и выделением из неефермента, отличающийся тем, что, сцелью повышения выхода и активности фермента, из ЕзсйегсЫа со 11 используют штаммВКМв, в качестве источника углерода и50 азота применяют дрожжевой и мясной экстракты.2. Способ по п. 1, отличающийся тем,что дрожжевой и мясной экстракты используют в соотношении 1: 1, а из солей исполь 55 зуют хлористый натрий, хлористый магний,двузамещенный фосфорнокислый натрий, однозамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый аммоний, хлористый аммоний в количествах соответственно равных, в г 10,0; 0,2;60 1 2,5; 5,0; 0,5; 0,5.3. Способ по п. 1 - 2, отличающийсятем, что культивирование осуществляют притемпературе 28 - 32 С,