Способ выделения фосфолипазы а2 из яда кобры

.Аавикаммония (удельная электропроводность 4,4 108 см , рН 7,4) колонку с пентил-агарозой (размеры колонки 2,1 16 см) наносят раствор яда, Ко- лонку элюируют с 0,045 М раствором уксусно-кислого аммония с удельнойэлектропроводностью 4,4 10 З 8 см рН 7,4 со скоростью 30 мл/ч, отбирают фракции по 15 мл, Оптическую плотность элюата. регистрируют непрерывно с помощью "Увикорд". Остальные компоненты яда кобры кроме фосфолипазы А в данных условиях проходят колонку, а фосфолипаза А, имеющая оптимумгидрофобности и активно-.; сти при рЦ. 7,5, связывается на пентил-агарозе и ее элюируют градиентом ионной силы концентрацией уксуснооб М оренныи яд цент 0 об/мин при 4 СОсадок выбрасывают,ь используют дляуравновешеннуюм уксусно-кислого ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИПРИ ГННТ СССР.(71) Институт химической и Ьцологической физики АН ЭССР и Опытный завод органического синтеза и биопрепаратов Института химии АН ЭССР(54)(57) СПОСОБ БЫДЛБНИЯ ФОСфОЛИПАЭЫА ИЗ ЯДА КОБРЫ, включающий раствореИзобретение относится к ферментной промышленности, в частности к получению чистой фосфолипазы А из яда кобры.Целью изобретения является упрощение процесса и повышение степени очистки целевого продукта,П р и м е р 1, К 1,0 г яда к рыдобавляют 8,0 мл раствора 0,045 уксусно-кислого аммония с удельной-1 электропроводностью 4,4 10 В см рН 7,4, смесь медленно перемешивают 4 ч при 4 оС, Растврифугируют при 500в течение 30 мин.насадочную жидкостхроматографии, Нас 0,045 М растворо нйе яда в буферном растворе с последующим центрифугированием, выделением целевого продукта путем аффинной хроматографии, элюции и лиофилизации, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью упрощения процесса иповышения степени очистки целевогопродукта, растворение проводят в0,045-0,055 М буферном растворе, уксусна-;ислого аммония при рН 7,4-7,6,опн.ую хроматограф го осуществляотна пентил-агарозе и ".ам же буферномрастворе, а эмоцию в 0,45-5.55 Мрос творе уксусно-кислого аы;ония илиафилизируют полученный растворона:,цы,,Заказ 4341 Тираж 542 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета,по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж,- Раушская наб., д, 4/51 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул, Гагарина,101 кислого аммония 0,45 М с удельнойФщ.1электропроводносты 32-10 Б смрН 7,4. Фракции, имеющие фосфолипаэ-.ную активность, объединяют (выход92 мл) и лиофилизируют дважды.Характеристика препарата: выход65,1 ., Степень очистки 25 раз.П р и м е р 2, К 1,0 г яда кобрыдобавляют 8,0 мл раствора 0,050 Муксусно-кислого аммония с удельной-Ээлектропроводностью 4,510 Я смрН 7,5, смесь медленно перемешиваютв течение 4 ч при 4 С, Растворенныйояд центрифугируют при 5000 об/минпри 40 С в течение 30 мин. Осадоквыбрасывают, надосадочную жидкостьиспользуют для хроматографии. Науравновешенную с 0;050 М растворомуксусно-кислого аммония (удельнаяэлектропроводность 4,510 Я смрН 7,5) колонку с пентил-агарозой:удельной электропроводностью 4,5 кю 10 Э Я см , рН 7,5 со скоростью30 мл/ч, отбирают фракции по 15 мл. 30. Оптическую плотность элюата регистри-руют непрерывно с помощью "Увикорда 11", Остальные компоненты яда кобрыкроме фосфолипазы А в данных условиях проходят колонку а фосфолипаза 35А, имеющая оптимум гидрофобности иактивности при рН 7,5, связываетсяна пентил-агарозе и ее элюируют0,50 М раствором уксусно-кислого аммония с удельной электропроводно-, 40стью 34 10 Э Б см, рН 7,5. Фракции,имеющие фосфолипазную активность,объединяют. (объем 90 мл) и лиофилизируют дважды.Выход препарата 65,3 и степень 45очистки 25,2 раз,Редактор О,филиппова Техред М.Дидык П р и м е р 3. К 1,0 г яда добавляют 8,0 мл раствора 0,055 М уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 4,6,10 Я см , рН 7,6,смесь медленно перемешивают 4 ч при4 фС. Растворенный яд центрифугируютпри 5000 об/мин при 4 С в течение30 мин. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для хроматографии. На уравновешенйую с 0,055 Мраствором уксусно-кислого аммония(удельная электропроводность 4,6 КК 10 Я см , рН 7,6) колонку с пентил-агарозой (размеры колонки 2,1 дк 16) наносят раствор яда,Колонку промывают с 0,055 1 раствором уксусно-кислого аммония судельной электропроводностью 4,6 ф10 Я см , рН 7,6 со скоростью30 мп/ч, собирают фракции по 15 мл.Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью "увикорда". Остальные компоненты ядакроме фосфолипаэы А в данных условиях проходят колонку, афосфолипаэа А, имеющая оптимум гидрофобностии активностипри рН 7,5 связываетсяна пентил-агароэу и ее элюируют0,55 М раствором уксусно-кислого аммония с удельной электропроводностью36,10"Э Б см , рН 7,6. Фракции, содержащие фосфолипазную активность,объединяют объем 92 мл) и лиофилизируют дважды.Выход препарата 65,0% и степеньочистки 25 раз.Технико-экономическая эффектив-.ность использования предлагаемогоспособа выражается в возможностиколичественного выделения фосфолипазы А из яда кобры простым и дешевымспособом, а остальной яд без фосфолипазы А можно использовать для пойлучения других биоактивных белковили после высушивания сохранить.