Способ выделения ацетилхолинэстеразы

(51)М. Кл. С 07 С 7/02 Веудерстеевай кемвтет СССР де делам взверетеввв в еткрмтв 1(53) УД 1(577. 15. .07 (088.8) Дата опубликования описания 17,03.80 В, А. Смирнов и А. Н. Панюков(72) Авторы изобретения Институт токсикологии Министерства здравоохранения СССР "-.,(71) Заявитель(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИ 51 АПГП 1 ЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способамочистки ферментных препаратов - к способу выделения ацетилхолинэстервзы(Кф 3,1.1.7) из яда среднеазиатскойкобры,Целевой продукт может быть использован в качестве лекарственного средства, например, при лечении шоковыхсостояний, а также как компонент систем1 Одля определения низких концентрацийфосфорорганических инсектицидов.Известны способы выделения ацетилхолинэстеразы из животных тканей,например из ткани мозга 1,1,15Известен способ выделения ацетилхолинэстервзы (АХЭ) нз яда среднеазиатской кобры путем двухступенчатойколоночной хроматографии на сульфоэтилпроизводном декстрана в буферныхрастворах И.Преимуществом этого способа является использование в качестве источника фермента яда среднеазиатской коб ры, отличающегося высоким содержанием АХЭ (около 20000 Е/г сухого яда),Недостатки известного способа состоят в низкой удельной активности получземого препарата (61 Е/мг белка) и в низком выходе фермента (13%). Эти недостатки обусловлены тем, что используемое в качестве ионообменного сорбеита сильнокислое сульфоэтилпроизводное декстрана вызывает в процессе выделения значительную денатурвцию фермента.Целью предлагаемого способа является устрзнение недостатков известного способа, а именно получение из яда кобры АХЭ с высокой удельной активностью и с высоким выходом. Другой целью является комплексное использованне яда.Согласно изобретению выделение фермента из яда кобры проводят ступен чатой колоночной хроматографией с ис,- пользованием на первом этапе слабо- кислого ионообменника, кврбокснметил5 О 15 20 25 Зо 35 40 45 50 55 проазводного декстрвна, в буферномрастворе. На этом этапе наряду с АХЭудается получить препараты пяти низкомолекулярных физиологически активныхпептидов, что приводит к более полномуиспользованию дефицитного сырья. Последующую очистку целевого продуктапроводят последовательной хроматографией на колонках с диэтиламиноэтилпроизводным декстрана и с гранулированнымгидроксиапатитом в буферных растворах,содержащих в качестве стабилизатораактивности фермента глицерин, в количестве 10 вес.о .Согласно изобретению предлагаетсяспособ выделения ацетилхолинэстеразыиз яда среднеазиатской кобры с высокойудельной активностью фермента и высокимвыходом, при комплексном использованиисырья:путем ступенчатой колоночной хроматографии с использованием на первойступени карбоксиметилпроизводного декстранв, на второй ступени - диэтиламиноэтилпроизводного декстрвна, а на третьей - гидроксиапатита, Способ осуществляют в присутствии буферов и предпочтительно при 2 - 8 С, Элюцию ацетил 0холинэстеразы на первой ступени осуществляют обычно линейным градиентом,образованным смешиванием 0,01 М уксусно-аммонийного буфера рН 5,01,0 М уксусно-аммонийным буферомрН 7,0, Элюцию АХЭ на второй ступениосуществляют обычно линейным градиентом, образованным смешиванием 0,01 М. трис- НСК буфера рН 7,8 с 0,5 М раствором. МаСц в том же буфере,Элюцию АХЭ на третьей ступени осуществляют обычно 0,5 М раствором НОСв 0,01 М Юа-фосфатном буфере рН 7,6.Буферные растворы на второй и третьей ступенях содеркат глицерин: в количестве 10 вес.%,Предпочтительно процесс выделенияАХЭ проводят следующим образом.Обессоленный яд среднеазиатскойкобры наслаивают нв колонку с карбоксиметилпроизводным декстрана, уравновешенным уксусно-аммонийным буферомрН 5,0. Элюцию связавшегося материалапроизводят линейным (по молярностибуферных растворов) градиентом, образованным смешением уравновешивающегобуфера с 1,0 М уксусно-аммонийнымбуфером рН 7,0. При атом наряду спрепаратомАХЭ удается получить лрепараты пяти,низкомолекулярных физиологически активных пептидов. Использование на первом этапе очистки АХЭ слабокислого производного декстрана позволяет снизить денатурвцию фермента, наблюдаемую при использовании сильно- кислого производного декстрана. Последующая очистка целевого продукта проводится на диэтиламиноэтилпроизводном декстрана. Для снижения денатурации АХЭ с этого этапа очистки в буферные растворы добавляют глицерин (10% по объему). Элюцию АХЭ с колонки с диэтиламиноэтилпроизводным декстрана, уравновешенным 0,01 М трис-НС буфером рН 7,8, содержащим 10% глицерина, проводят линейным градиентом, образованным смешением уравновешивающего буфера с 0,5 М ЦаСЯ в том же буфере, Последний атап .очистж состоит в хроматографии АХЭ на колонке с гранулированным гидроксиапатитом, уравновешенным 0,01 М йо -фосфатным буфером рН 7,6, содержащим 10% глицерина. Элюцию фермента проводят 0,5 МИаСК в том же буфере. Этот этап вьшеления позволяет в еще большой степени очистить и сконцентрировать целевой продукт. Замена на этом этапе трис-НС 8 буфера на фосфатный облегчает определение концентрации белка методом Лоури. Полученный препарат АХЭ, как следует из результатов электрофоретического анализа, гомогенен. Молекулярный вес фермента 110000 т, 10000, Фермент гидролпзует ацетилхолин АТХ (К;1,3 х х 10 М), мехолин (К,=2,2 х 10 М) и практически не гидролизует бутирилхолин. Высокие концентрации ацетилхолина и мехолина угнетают активность фермента. Величины констант второго порядка взаимодействия препаратов АХЭ с фосфор- органическими ингибиторами АХЭ составляют (0,85-6,7) х 10. М ф мин 1, что в 2 раза выше констант взаимодействия этих же соединений с препаратом АХЭ из эритроцитов человека (АХЭЧ). Разбавленный раствор фермента (1 Е/ил) в забуференном растворе (0,02 М натрийфосфат рН 7,6) альбумина (0,2%) или глицерина (10 о ) инактивируется при 37 С нв 10% за 1 ч, а при (4-6) С нв 107 о за 1 сут. Температурный оптимум гидролиза АТХ ферментом, разбавленным 0,15 М йаС 9, составляет 20 С, в фермента, разбавленного раствором вльбчмина (0,2%) или глицерина (10%) 37 оС5 72Пример.1) Высушенный над хлористым кальцием яд кобры (2 г, удельная активность АХЭЕ/мг сухого яда) растворяют в 20 мп дистиллированной воды и обессоливают на колонке (Зх 60 см) с сефадексом Г, уравновешенным 0,01 М уксусно-аммонийным буфером рН 5,0. Скорость элюции 48 мл/ч.2) Обессоленный яд (около 30 мл раствора) наслаивают на колонку (Зх х 60 см) сКМ- сефадексом С, уравновешенным этим же буфером, и элюируют градиентом, образованным смешиванием 2,5 л этого же буфера с 2,5 л 1,0 М уксусно-аммонийного буфера рН 7,0. АХЭ выходит при концентрации соли около 0,4 М в объеме 120 мл. Выход фермента 98% очистка в 48 рвз.3) Раствор фермента, полученный на этапе 2, разбавляют в 5 раэ 0,01 М трис-НСВ буфером рН 7,8 и добавляют глицерин до 10/о, после чего наслаивают на колонку (2,5 х 20 см) с ДЭАЭ-сефадексом А, уравновешенным 0,01 М трис-НС 1 буфером рН 7,8 с 1 С 86 глицерина. Элюцию связавшихся белков проводят градиентом, образованным смешиванием 0,5 л этого буфера с 0,5 л 0,5 М Й аСВ в этом же буфере. АХЭ выходит при концентрации ЙаС около0,15 М в объеме 150 мл. Выход фермента около 55/о, очистка в 196 раз. 4) Раствор фермента, полученный на этапе 3, разбавляют в 5 раз 0,01 М натрийфосфатным буфером рН 7,6 с 10% глицерина и наслаивают на колонку (2 х 10 см) с грацулировацным гидроксиапатитом. Колонку промывают буфером и эпюцруют связавшийся фермент 0,5 М ИаС 0, в этом же буфере. Получают 20 мп раствора АХЭ. Выход фермента 40% активность 9670 Е/ мг белка.5) Раствор фермента, полученный на этапе 4, обезвоживвют пцофипизаццей. Раствор фермента в глицерине хранитсяопри 4-6 С без потери активности. Все операции по выделению фермента проводят при (4-6)+ 2 С. Активность фероМента определяют по гцдролизу ацетилтиохолцна (АТХ), 1 Е активности соответствует количеству ферментагвдролиэуюшего 1 мк моль АТХ эа 1 мин,1450 6формула изобретения1. Способ выделения ацетипхолицэстервзы из яда среднеазиатской кобрыпутем ступенчатой копоночцой хромато 5грвфци нв производных декстрвна в буферных растворах, о т л и ч в ю ш и йс я тем, что, с целью получения ацетилхолинэстервзы с высокой удельной активностью и увеличения выхода целевогопродукта, а также с целью комплексногоиспользования яда, колоночную хроматографию осуществляют в три ступени,в качестве производного декстрвна напервой ступени применяют карбоксиметил 1 производное декстрана, на второй - диэтиламиноэтилдроизводное декстрана, ахромвтогрвфирование на третьей ступениосуществляют на гидроксиапатите, причембуферные растворы на второй ц третьейступенях.содержат глицерин в количестве 10%,2. Способ по п, 1, о т л и ч а юш и й с я тем, что выделение ацетилхоолпцэстеразы проводят прц 2-8 С.З.Способпопп. 1 и 2,отличаю 25 ш ц й с я тем, что элюцию вцетилхопццэстервзы с колонки с кврбоксцметилпроизводным декстрвцв проводят линейным (по молярностц буферных растворов)градиентом, образованным смешиваниемзо 0,01 М уксусно-аммонийного буферарН 5,0 с 1,0 М уксусцо-аммоцийцымбуфером рН 7,0,4. Способ по пп. 1-3, о т л и ч а юш ц й с я тем, что элюцию вцетилхолинЗ эстераэы с колонки с диэтипаминоэтилпрсиэводцьм декстрвнв проводят линейным градиентом, образованным смешиванием 0,01 М трцс - НС 1 буферарН 7,8 с 0,5 М раствором "оС 9 в том4 О же буфере,5. Способ по пг 1 - 4, о т л ивч а ю ш и й с я тем, что эпюццювцетцлолинэстеразы с колонки с грацупироввцным гцдроксцапатитом прово 45 дят 0,5 М раствором йаС и 0,01 МЙа -фосфатном буфере рН 76.Источники информации,принятые во внимание прц экспертизе1. Авторское свидетельство СССР50 Мо 267815, кл. А 61 К 37/48,20. 12.68,2, Нигматов 3., Сорокин В. С. Выделение холинэстеразы цз яда среднеазиатской кобры. Узбекский бцологц 55 ческий журнал, 1972, 6. 16 (прототип).