Способ получения средства, селективно тормозящего рост или размножение нормальных и лейкемических клеток миелоидов

.ТУ ПА Лайклош(72) Андра ош Кишфалу не Барабаш (53),615.45 ш Балаж,Михай Шай ди, Тибор Клуг.п и (Н 0)СЕ- РАЗ- ЕСКИХ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ 21) 3230703/28-1422) 14.01.8131) 68/8032) 15.01.8033) НП46) 15.01.88. Бюл. Р 271) Рихтер Гедеон ВедьесетиНЦ) 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВ ЕКТИВНО ТОРМОЗЯЩЕГО РОСТ ИЛИМНОЖЕНИЕ НОРМАЛЬНЫХ И ЛЕЙКЕМИЧКЛЕТОК МИЕЛОРЩОВ(57) Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения - повышение активности целевого продукта. Кровь лошади обрабатывают гепарином. После отстаивания верхний слой отделяют и центрифугируют. Осадок, содержащий клеточную популяцию, суспендируют в фосфатном буфере и центрифугируют. Полученный осадок гранулоцитов суспендируют и гомогениэируют. Гомогенизат центрифугируют и отделенную жидкость подвергают ультрафильтрованию, отделяя фракцию с молярной массой менее 10000. Фильтрат лиофилизируют, растворяют в растворе кислого карбоната аммония и подвергают гель- В кроматотращии. Осащцеииую фракцию от- Ощ целают и лиофилИаируют. Вещество, выделенное из гранулоцитов, тормозит размножение только миелоидных клеток.2 табл.7837 2 1 136Изобретение относится к медицине,в частности к способам получения эф фективных веществ из здоровых клетоккрови.Пелью изобретения является повыше ние активности целевого продукта.Способ осуществляется следующимобразом.Здоровые белые кровяные тельца,полученные из крови животных или человека, предпочтительно из крови лошади, гомогенизируют в буферном растворе рН 7-8, жидкий гомогенизат центрифугируют, из жидкой части выделяютрастворимые составные части с молекулярной массой менее 10000 с помощьюмолекулярного фильтрования и затемэту фракцию подвергают дальнейшемуфракционированию путем гель-хроматографии. Выделяют фракцию, осаждающуюся между объемными значениями че/ч1,15 и 1,45, и лиофилизируют.Кроме того, способ может бытьосуществлен следующим образом.Органы животных, предпочтительнотелячью селезенку, содержащие гранулоциты, гомогенизируют в смешивающемся с водой растворителе, предпочтительно в ацетоне. Из полученнойжидкой сусйензии вьщеляют твердоевещество путем центрифугирования,экстрагируют растворяющим жир органическим растворителем, преимущественно хлорсодержащим углеводородом,твердый остаток экстрагируют водой(нерастворимую часть целесообразноотделять центрифугированием) и изполученной жидкой части вьщеляютрастворенные составные части с молекулярной массой менее 10000 путеммолекулярного фильтрования. Этуфракцию подвергают дальнейшему фракционированию, преимущественно путемгель-хроматограФии, Отделяют фракцию,осаждающуюся между значениями ч /ч1,3 и 2,5, и лиофилизируют последнюю,Затем полученный по одному из приведенных вариантов способа или продукт (фракция С 1-3) очищают хроматографическим методом или бумажным электрофорезом и вьщеляют положительно реагирующий на хлортолидин пептид (белок), показывающий отрицательный заряд при рН 6,5 и относительную подвижность между -0,55 и -0,65, считая на аспарагиновую кислоту, и отсутствие заряда при рН 1,9 и подвижность 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 0,26, считая на Е -ДНП-лизин, послечего лиофилизируют. П р и м е р 1. Получение фракцииС 1-3 из крови лошади, 10 л крови лошади обрабатывают3500 ед/л гепарина, затем для седиментации выдерживают при комнатнойтемпературе в течение 30 мин. Верхний богатый лейкоцитами слой отделяют и центрифугируют при 800 я. Полученную в качестве осадка .содержащую 807 гранулоцитов клеточную популяцию затем суспендируют в 200 мл 0,06 М фосфатного буферного раствора с рН 7,4 (состав: 9,500 г двуосновного кислого ортофосфата натрия, и 1,815 г двуосновного кислого ортофосфата калия в 1 л дистиллированной воды) и вновь центрифугируют при 800 8. Полученный осадок гранулоцитов суспендируют в таком же фосфатном буферном растворе9в концентрации 4 10 клеток/мл и гомогенизируют в гомогенизаторе Поттера при 10 об/минПолученный гомогенизат центрифугируют при 1550 я и отделенную жидкость подвергают ультрафильтрованию через мембрану Амикон РМ 10 под давлением 3 атм, отделяя фракцию с мо-. лярной массой менее 10000. Полученный фильтрат лиофилизируют, лиофилизат растворяют в буферном растворе кислого карбоната аммония (рН 7,9) и подвергают гель-хроматографии на колонке Сефадекс-С 10. фракцию,осажденную между значениями ч /ч, 1,15 и 1,45, отделяют и лиофилизируют. Таким образом получают 65 мг концентрата эффективного вещества (фракция С 1-3) в виде белого порошка.П р и м е р 2. Получение фракции С 1-3 из селезенки теленка.11000 г очищенной и измельченной селезенки теленка смешивают с охлажденным до 4 С ацетоном до полученияообщего объема 4 л, смесь гомогенизируют при этой температуре в течение 60 мин, инкубируют и затем центрифугируют. Отделенное твердое вещество, промывают и высушивают в вакууме при 20 С.Сухое твердое вещество экстрагируют 2 л хлороформа в течение 30 мин, затем твердое вещество отделяют, высушивают при комнатной температуре в течение 16 ч, после чего перемешивают с 3 л дважды дистиллированной воды и центрифугируют при 2000013678 Т а блица 1 Селективное действие 100 мкг/мл СР на введениез Н-тимидина в кислотонерастворимую дезоксирибонуклеиновуюкислоту в культурах костного мозга и Тйупщз1 Торможениев ТЬушцзе, 7 от конт- роля Количествоопытов Торможениев костноммозге, Е отконтроля 0,001 14,6 0,2 53,2 14 59,9 7,3 Отделенную жидкость лиофилизируют,лиофилизат растворяют в 0,05 М буферном растворе кислого карбоната аммония (рН 7,9) и прдвергают гель-хроматографии на колонке Сефадекс С.Фракцию, осажденную между значениямич /ч, 1,3 и 2,5, отделяют и лиофилизируют. Таким образом получают 3,54 гконцентрата эффективного веществаС 1-3 в виде белого порошка,П р и м е р 3. Получение чистогоэффективного вещества СР.300 мг концентрата эффективноговещества С 1-3 ( полученного по примеру 1 или 2) наносят на хроматографическую бумагу ватман 3 мм (исходный пункт расположен в середине листа, и общее количество нанесенногообразца распределяется по длине30 см). Электрофорез проводят в буферной смеси из пиридина, уксуснойкислоты и воды в объемном соотношении 90:4:900 (рН 6,5) в аппарате дляэлектрофореза с горизонтальным расположением с градиентом напряжения50 В/см в течение 2 ч. Положение кислого положительно реагирующего нахлор и отрицательно на нингидринкомпонента определяют по окраске 30хлортолидином. Полученный таким образом активный компонент элюируют сбумаги буферной смесью из уксуснойи муравьиной кислот и воды в объемномсоотношении 8:2:90 (рН 1,9) и в такой же буфернойсмеси подвергают дополнительному электрофорезу с градиентом напряжения 80 В/см в течение90 мин. Положение активного компонента определяют с помощью хлортолидина. Активный компонент элюируюттакой же буферной смесью (рН 1,91) 37 4и элюат лиофилизируют, Таким образом получают 8 мкг чистого эффективного вещества СР в виде белого порошка.П р и м е р 4. Получение действующего материала СР из крови теленка.Из 10 л дефибринированной крови теленка посредством спонтанного осаждения вьделяют фракцию, содержащую 867 гранулоцитов и 143 одноядерных клеток. Затем гемолизуют в течение 5 мин 0,852-ным раствором хлорида аммония, центрифугируют, осадок промывают физиологическим раствором поваренной соли. Полученные таким образом клетки гомогенизируют в буферном растворе и обрабатывают, как в примере 1. П р и м е р 5. Получение действующего материала СР из крови человека.1 л крови от здоровых доноров,принадлежащей к одной группе, подвергаоют осаждению при 4 С в течение 4 ч, Полученные белые кровяные тельца содержат примерно 757 гранулоцитов и 253 лимфоцитов. Затем клетки гомогенизируют в буферном растворе и обрабатывают, как в примере 1.При этом по примерам 4 и 5 получено соответственно 60 и 5,6 мг концентрата активного вещества, обработанного, как в примере 3, с теми же характеристиками.Результаты опытов,.проводимых п чдСго для определения эффективности вьделенного с помощью ионообменной хроматографии или бумажного электроФореза эффективного вещества СР в сравнении с фракцией С 1-3, приведены в табл. 1 и 2.7837 емоцитам, человеческим лимфоидным лейкемическим кровяным клеткам и Не 1 ачеловеческим опухолевым клеткам.5Частично очищенная фракция С 1-3Эполученная в качестве промежуточногопродукта в соответствии с предлагаемым способом, содержит также эффективное вещество СР, но не в чистомвиде, а совместно с различными менееактивными компонентами и, в основном,со значительным количеством неактивных примесей, такую же фракцию получают и по способу-прототипу. Данная 15 фракция обладает также тормозящимдействием против размножения миело-,идных клеток; п ч 1 го минимальнаяэффективная доза фракции С 1-3 приторможении внедренияН-тимидина вкислотонерастворимую ДНК 110 мкг/мл,в случае колоний в . 8 мкг/мл. 136 Т а блица 2 Тормозящее действие на Действующеевещество образовавведение Н- тимидина в суспензионную культуру костного мозга, 3-4 ч ние колоний в капиллярахс гелем агара, 7 дней С 1-3МЭК, мкг/мл 100 ЕР , мкг/мл 430 90 МЭК, мкг/мл 2,5 0,2 формула изобретения Е 0 , мкг/мл 7,8 1,6 Способ получения средства, селективно тормозящего рост или размножение нормальных и лейкемических клеток миелоидов, путем выделения из крови человека или телят гранулоцитов или лимфоцитов, гомогенизации, центрифугирования гомогенизата в изотоническом,водном растворе с последующим отделением жидкой фазы, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, в качестве сырья используют кровь лошадей, которую гомогенизируют в буферном растворе с рН 7,4, затем после центрифугирования жидкую фазу подвергают молекулярному фильтрованию, отделяя фракцию с молярной массой не менее 10000, после чего выделенную фракцию наносят на хроматографическую колонку и отделяют фракцию, осаждающуюся между значениями ч /ч 1,15 и 1,45, которую лиофилизируют и затем очищают методом хроматографии и/или бумажным электрофорезом с последующей повторной лиофилизацией..Шилинавчук Корректор С.Шекмар МЭК - минимальная эффективная концентрация, 30 Следовательно, полученное в соответствии с изобретением эффективное вещество СР можно применять в качестве биологического эффективного вещества для торможения пролифера 35 ции йормальных или лейкемических кровяных клеток человека или клеток костного мозга п ч 1 го в концентрациях от 0,2 до 10,0 пмоль/мл.Новое вещество, выделенное из гранулоцитов вышеописанным способом в лиофилиэированной форме (эффективное вещество СР), обладает более эффективным действием: оно тормозит специфически размножение миелоидных клеток, но является неэффективным по отношению к нормальным тимоцитам, ПХА-стимулирующим лимфоцитам, субакутным лимфоидным лейкемическим тиюСоставитель ЛРедактор Л.Веселовская Техред А.Кра ао Заказ 6853/57 Тираж 655 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная,4