Способ получения эндонуклеазы рестрикции 1

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК П 9)01 А 9/16 РР дЦь 1Ч % ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ВИДЕТЕЛЬСТВУ АВТОРСН 8-13 А. 81, т,ЛЕразГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ"БиоорганичеМ 5 ф с, 790(54)(57) СПОСАЗЫ РЕСТРИКЦИ Бюл, 9 .30ев, Ю.С.Ничаев,и М.Я,Хейслере88, 8)тсонтиц и1974,С.В., Грачев С.кая химия", 1991 (прототип) .ОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОНИ М зр 1, включающи рушение биомассы в присутствии детергента, фракционирование полученноголизата центрифугированием, хроматографию,и диализ, о т л и ч а ю щи йс я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и упрощенияпроцесса, разрушение клеток проводятсмесью лизоцима и тритона Х 100 (10:1а клеточные компоненты фракционируют в двухфазной системе, содержащей7,0-7,5 Ъ-ный полиэтиленгликоль молекулярного веса 6000 и 2,0-2,1-ныйдекстран Т 500 при рН 6,0-6,5 в присутствии 0,50-0,52 М БаС 1,1108106 Ти Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул,Проеткная, 4 Изобретение относится к получениюФерментов нуклеинового обмена из микробных клеток, в частности к способувыделения эндонуклеазы М яр(, из биомассы Могахе 11 а ярес 1 ея. Препаратфермента может быть применен в различных молекулярно-биологическихисследованиях и при проведении генноинженерных работ,Известен способ выделения ферментов в системе двух образующих фазы 10водорастворимых полимеров - полиэтиленгликольдекстран С 1 1,Недостаткомспособа является низкий выход ферментов.Наиболее близким к изобретению 15по технической сущности и достигаемому результату является способ выделения рестриктазы М яр 1, включаю щий суспендирование биомассы в калийфосфатном буфере рН 7,0, содержащем0,2 М НаС 1, 1 мМ ЭДТА, 7 мМ Ъ -меркаптоэтанола, 1 мМ азида натрия и0,1 тритона Х 100, последующее разрушение клеток ультразвуком,фракционирование клеточных компонентов спомощью ультрацентрифугирования,хроматографию на фосфоцеллюлозе иоксиапатите, диалиэ и концентрирова.ние фермента (.22.Недостатком способа является невысокий выход рес три кта зы, о 6 условле н ныйпотерями при многостадийной очистке.Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта и упрощениепроцесса.Поставленная цель достигается 35тем, что согласно способу полученияэндонуклеазы рестрикции.М яр , включающему разрушение биомассы в присутствии детергента, фракционированиеполученного лизата центрифугированием, хроматографию и диализ, разрушение,клеток проводят смесью лизоцимаи тритона Х 100 (10:1), а клеточныекомпоненты фракционируют в двухфазной системе, содержащей 7,0-7,5-ный 45полиэтиленгликоль мол,в, 6000 и 2,02,1-ный декстран Т 500 при рН 6,06,5 в присутствии 0,50-0,52 М МаС 1.Способ осуществляют следующимобразом, 50Биомассу Могахе 11 а ярес 1 ея лизируют с помоцью лизоцима в присутствии тритона Х 100, затем фракционируют в двухфазной системе полиэтиленгликольдекстран (конечная концентрация в смеси полиэтиленгликоля557; декстрана 2," ИаС 1 0,5 М; рН 6,3)После тщательного перемешиваниясмеси и последующего центрифугирования отбирают верхнюю фазу, содержащую целевой продукт, наносят на ко" 60лонку с фосфоцеллюлозой и проводятэлюцию градиентом концентрации БаС 1.ВНИИПИ Заказ 5838/18 Фракции, содержащие эндонуклеазуМ яр 1собирают и концентрируютдиализом против 55-ного глицерина,П р и м е р , 5 г замороженнойбиомассы Могахе 11 а ярес 1 ея суспендируют в 10 мл 0,01 М Трио -НС 1-буферарН 7,2, содержащих 0,01 М ь -меркаптоэтанола, 1 мМ азида натрия и 1 мМЭДТА (буфер А), к суспензии добавляют 150 мкл 10-ного тритона Х100 и 15 мг лизоцима, лизируют 1 чпри 0-4 С и постоянном перемешивании.Полученный лизат добавляют к смеси, состояцей из 3,7 мл 15-ноговодного раствора декстрана Т 500,5,6 мл 35-ного водного раствора полиэтиленгликоля 6000 и 3,5 мл 4 МИаС 1 (рН 6,0), тщательно перемешивают 15 мин, центрифугируют на холоду20 мин при 4000 об/мин, Верхнюю фазу отбирают, разбавляют в 2 раза буФером А, добавляют 10-ный раствортритона Х.100 до конечной концентрации 0,1 и наносят на колонку сфосфоцеллюлозой р(ч=25 смз),уравновешенную буфером А, содержацим 0,1-ный тритон Х 100 (буфер Б) .Колонку промывают 50 мл буфера Б ифермент элюируют 0-1,0 М линейнымградиентом концентрации ИаС 1 в буфере БОбщий объем градиента 150 мл,Скорости нанесения на колонку, промывки и элюции 15 мл/ч. Фракции,содержацие целевой продукт, которыйвымывается в диапазоне концентрацийНаС 1 0,45-0,55. М, объединяют (ч=18 мл), переносят в диализный мешоки концентрируют против 200 мл буфераБ, содержащего 55-ный глицерин.Время диализа 5-8 ч, Полученный препарат эндонуклеазы М яр, (4,0 мл,75000 ед. акт. по гидролизу ДНК рВВ322) хранят при -20 С,.Тестирование препарата ферментана содержание неспецифических примесных ДНКаз и фосфатаз определяютинкубацией 5-фри меченого гетероолигодезоксирибонуклеотидас избыткомтестируемого Фермейта.Инкубацию 10 пикомолей 5 -1 Р.) меченого рдТ-дС-дС-дА-дС-дА-дТ-дС- дТ-д 6-дС-дА проводят в присутствии 20,40 и 90 ед. акт, эндонуклеаэы М яр , выделенной способом-прототипом и предлагаемым сПособом.Сравнение полученных результатов показывает, что оба препарата фермента одинаково свободны от примесных нуклеаз и фосфатазПолученный препарат эндонуклеазы рестрикции М яр пригоден для физического картирования геномов про- и эукариот и для проведения различных генно-инженерных экспериментов. раж 522 Подписное