Способ ферментативного получения пептидов

.04,80) ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР О делАм изОБРеТений и ОтнРыт(71) Карлсберг Биотехнолоджи Цтд А/С (ЭК)(72) Джек Таанинг Йохансен и Фред Видпер (И 1)(56) Таоба 1 Ожог М. Буп 1 ез от" рерМо 1 з ж 1 Ь рго 1 ео 1 Ихс епкушз.- Вп 3.1. Селеш. Бос дарап, 1977, 50, 2762-65.Патент Великобритании У 1533129, кл. С 07 С 103/52, опублик, 1978, (54) СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ(57) Изобретение относится к пептидам, в частности к способу Ферментативного получения пептидов общей формулы А"В, где А=11-концевой Ь аминокислотный остаток или пептидный остаток состава 2-6 Ь-аминокислот, содержащий Ь-аминокислоту (АК) на его С-терминальном конце и необязательно защитную группу на Б-терминальном конце; В= аминокислотный ос. таток, который может быть С-терминально защищен, применяемых в синтезе биологически активных соединений, Цель изобретения - упрощение процесса. Синтез пептидов ведут из аминокислотной (АКК) и субстратной компонент (СК) в растворе в присутствии фермента. В качестве АКК используют выбранные из группы соединения Н"В-ОН (В указано выше); амид с необязательно И-замещенной АК Формулы Н-В-ЬНН сложныи зАир АК Формулы Н-В-ОН, где В указано выше; Н =Н: ОН; ИН,; С -С 4-алкил; Н=С, -С- алкил, В качестве СК используют выбранное из группы соединение; сложный эфир аминокислоты или пептида, или депсипептида Формулы А - ОН,; амид АК или пептида Формулы А-МН 1 или пептид Формулы А,-Х, где А указано вьппе; Н -С,-С-алкил, бензил или Й-дезамийо-Фрагмент 01 у, А 3.а или РЬе; А= АК или ди-пентапептид; Х=Ь-АК, Процесс целесообразно проводить в дисперсии или в водном растворе, содержащем до 203 органичес- Гкого растворителя 1 низшего алканола, диметилформамида или полизтиленгликоля) при рН 7,6-0,5 25-45 С и исходной концентрации СК 0,01-0,15 моль и АКК 0,05-3 моль с последующим выделением необязательного защищенного пептида, после чего при необходимости отщепляют группы Н и Н,1 с помощью серинкарбоксипептидазного знзима ( карбоксипептидазаиз дрожжей или карбоксипептидазы СР-1 или СР-1 из проростков ячменя). Способ обеспечивает возможность проведения ,процесса в широком интервале рН 7,6- 10,5 при меньшем расходе Фермента (до 2-25 ммоль). 2 з,п. Ф-лы, 16 табл18 1378785 17 Пролинамид (0,3 М) 0 Вг-А 1 а-Рго-ИНг Амид глутаминовой кислоты (0,25 М) Вг-А 1 аи-БН 0 88 Т-Рйе-ОМе19 2-А 1 а-Рйеу-ИН Глицинамид (0,15 И) 100 Е-А 3.а 2 А 1 а-А 3 аГлицин амид е (10 мМ) 0,15 М 1 0,15 М) 100 Лейцин Е-А 1 а-Бег-ОМе (10 мМ еицинамид лицинамид (0,15 М) Лейцинамид (О,5 М)) 2-А 1 а-А 1 а-Тугу-ИН 10 ) 2-А 1 а-А 1 а-Туг-Ьец-МН 10 илаланинамид (0,2 М) 201 уу-РЬе-БН одукт осаждался Таблица 3 Катализированный карбоксипептидазой-Х синтез пептидов с аминокислотными гидразидами в качестве аминовой компонентыСубстрат Аминовая компонен378785 22 Таблица 4 Катализированный карбоксипепсидазой-У синтез пептидов с аминокислотными эфирами в качестве аминовой компоненты Продук иновая компонента-А 1 а-С 1 у-ОН тиловыи зфи Леи-Ви)-О слоть етионинм0,2 М) иловыи эфи тиловый эй Метио( -1-Вп) глкислоты (О бутиловый иновой ки М) Вг-А 1 а-Ьеы-ОНВг-А 1 а-Ьеи-Ьеи-ОНВг-Ыа-Ьеп-Ьеи-Ьеи-ОНВг-А 1 а-Ьеи-Ьеи-Ьеи-Ье Вг-А 1 а-РЬе-ОНВг-А 1 а-Рпе-Рпе-ОНВг-А 3.а-Рпе-Рпе-Рпе-О Вг-А 1 а-Ме 1- Вг-АЪа-Ме- Вг-А 1 а-Ме- Вг-А 1 а-Ме 1- -ОН ОН1 е 1-ОНМе 1-Ме 1-ОН 8 бМе 1-Ме 1-Ме 1(0,5 М) Гистидинметиловый эфи ку-ОМе50 мМ) Вку-Нз-ОН тидазой-У синтез п миновой компоненты ванный карбоксип ерами в качестве тализи изВыход, Х Продукт иновая компонента1378785 26 Таблица 6Выход ( в Е ) в синтезе пептидов с использованием различныхэФирных групп в качестве субстратных компонентов прикатализе карбоксипептидазой-У Аминоваякомпонента Субстрат Вгу-ОМе Вгу-ОР 1 ВгуБ Вгу-ОВИ 1(0,15 М) 100 Таблица 7Катализированный карбоксипептидазол-У синтез с депсипептидами вкачестве субстратных компонент Выход,71378785 27 28 Таблица 8Катализированчый карбоксипептидазой-У синтез пептидов при использованиипептидов в качестве субстратов Аминовая компонента.(10 М) 10 Таблица 9 Катализированный карбоксипептидаэой-У синтез пептидов при разных значениях рнПродукт Субстрат Аминовая компонента1378785 30 29 Продолжение табл,9 Глицинамид 1 1,3 М) Вг-А 1 а-С 1 у-И 11 Таблица 10Катализированный карбоксипептидазой-У синтез пептидов при различныхаминокислотных производных в качестве аминовой компоненты Аминовая компонента(0,50 М) Вг-А 1 а-С 1 у-ИН-СНз 20 Таблица 11Синтез пептидов с использованием карбоксипептидаз из проростков ячменяСР-1 или СР-1 Фермент Выход,Я Аминовая компонента Продукт (концентрация) Субстрат32 1378785 Т.а б л и ц а 12Сравнение каталиэируемого карбоксипептидезой-У синтеза пептидов прииспользовании в качестве субстратов пептидных эФиров с Л-концевымизащитными группами и без них 11 родукт Субстрат Аминовая компонента(50 мМ) Лейцинамид (0,15 М) А 3.а-А 3.а-А 3.а-Ьец г 75 Таблица 13 Катализированный карбоксипептидазой-У синтез пептидов при использовании 50 мМ Вк-А 3.а-ОМе в качестве субстрата и свободных аминокислот в качестве аминовой компоненты при наличиии отсутствии 20% метанола (МеОН) в 0,1 М КС 3., 1 мМ ЕНОТА Выход, % Продукт Аминовая компонента (концентрация) без МеОН с МеОН Валин (0,6 М)Треонин (1,2 М) 42 53 Вк-А 3.а-Ча 3.-ОН 61 Вк-А 3.а-Тт-ОН фенилаланин (0,16 М) Вк-А 3.а-РЬе-ОН 18 Лейцин (0,16 М)Метионин (0,5 М)Глицин (3,0 М)Серии (3,2 М)Лизин (1,5 М ) Вк-А 3.а-Ьец-ОН 39 Вк-А 3. а-Ме 1-ОН 42 64 Вк-А 3.а.у-ОН 50 50 Вк-А 3.а-Бег-ОН 41 Вк-А 3.а-Ьуз-ОН Д -С-бутилэфир глутаминовой кислоты (1,0 М) Вк-А 3.а.у(-ОБА)ОН 54 Аспарагин (0,6 М) 14 18 Вк-А 3.а-Азы-ОН34 1378785 Таблица 14Катализированный карбоксипептидаэой-У синтезВк-АЗ.а-Тйг-ОН из Вк-А 1 а-ОМе (50 мМ) и треонина приразличных концентрациях полизтиленгликоля)О 0,7 20 31 0,7 30 0,35 Таблица 15Катализированный карбоксипептидазой-У синтез пептидов из 50 мМВк-АЗ.а-ОМе и указанных аминокислотных эфиров в качестве аминовойкомпоненты в ЗЕ-ном полиэтиленгликоле, О, М КС 1, 1 мМ Е 1 ЗТАДругие условия: СРЗ-У 8 мкМ; рН 9,6; 25 С Аминовая компонентаАминовая компонента Продукт (концентрация) фенилаланин (0,15 М) Вг-А 1 а-РЬе 21 Вк-А 1 а-ОМе(50 мМ) Составитель ВВолковаРедактор А.Огар Техред Л.Олийнык Корректор А, Обручар Заказ 896/59 Тираж 348 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раунская наб д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 СубстратИзобретение относится к способам Ферментатинного получения пептидов, который может быть использован н синтезе биологически активных соеди 5 нений.Цель изобретения - упрощение процесса Ферментативного синтеза пептидов.Исходные материалы, 10Карбопепсидазу-, получаемую изхлебопекарных дрожжей, выделяли спомощью хроматографии средства, предложенной Йохансеном, и производилин виде лиофилизированного порошка(10% фермента н лимонно-кислом натрие),Перед использованием Ферментобессолинали на установке "БерЬайех025 Гпе" (1,5 25 см), уравновешивали и вымывали дистиллированной водой, Концентрацию Фермента определяли спектрофотометрически при условии11,Е =14,8, Приготавливали основ 2 ВОной раствор с концентрацией 7 мг/мл(для синтеза), растворители и реактивы (все аналитической чистоты)приобретали у Фирмы "Мерк", Дармштадт, ФРГ. Все аминокислоты, аминокислотные амиды и их производныезакупали у Фирмы Сигма Кемикал Компани", Сан-Луис, США. Карбобензилоксифенилаланинметиловый эфир (Е-РйеОМе) изготавпивали в соответствиис процедурой Ямада и др. и использо 40вали в виде сиропа. Фенилаланингидразид, аланингидразид и аланингидразидгидрохлорид изготавливали из эфиров в соответствии с описанием Лоссе и др, Нескорректированные т,пл,составляли 86-88 и 184-185 С (поизвестным данным 82-83 и 184-185 Ссоо гнетственно). Аспарагинамиддигидрохлорид получали из аспартановойкислоты и диэтилоного эфира по Фишеру с помощью классического аминолиза (т.пл, 210-214 С, по известнымданным 214-215 С), Другие исходныематериалы приобретали у укаэанныхФирм или производили аналогичным образом,Определение выходных продуктов,Чистоту определяли количественно с помощью ТЬС на силикагеле 60 Г (Мерк). Применяли растворительную систему СИСА(СН,(СН )д хОН(СНСООН)Н О (11:5;2:1). Пятна визуально проверяли на тушение флуоресценции для оценки состава реагентов.Состав реагентов определяли количественно на установке обращения Фазы НРЬС с помощью столба НР,10 мкм(Мерк) и хроматографа Хьюлетт Пакард1084, снабженного регистратором переменной длины волны (модель 79875 А),Разделение обеспечивали при использовании соответствующих удельныхградиентов в системах вымывания, составляющих от 10% СНС 1 н 10 ммольБаАс (рН 4) до 100% СНСИ или от10 ммоль 11 аАс (рН 4) до 100% СИ С.1.Последнюю систему использовали длятаких соединений, как Вг-А 1 в,-ГЦ.у-ОН,Вг-А 1 а-А 3.а-ОН, Вг-А 3.а- Бег-ОН, и соответствующих амидон. Скорость протекания 3 мл/мин, температура столбао47 С, рабочая длина волны 260 нм.Выходы определяли из молярного отношения реагентов, которое находилипо интегрированным площадям под пиками вымывания.Идентификация продуктов,Пятна идентифицировали методамикохроматографии тонких слоев с соответстьующими стандартными соединениями. Некоторые продукты идентифицировали с помощью сочетания методаНРЬС и аминокислотного анализа, Дляэтого из смеси реакции через 10 минзабирали аликвотные пробы объемом1 мл и реакцию останавливали добавлением 250 мкл 6 М НС 1, После этого рН доводили до 4 с помощью НаОНи смесь разделяли методом НРЬС с помощью оборудования фирмы "Уотерс",включающего дна насоса, программноеустройство составления растворителеймодели 660, инжектор модели ,6 К, регистратор переменной длины волны модели 450, совмещенный с самописцем(радиометр НЕС 61), или г чописецинтегратор фирмы "Хьюлетт-Пакард",модель 3380 А, Управление вымываниемосуществляли с помощью сканированияна подходящей длине волны от 255 до280 нм, Хроматографию осуществлялиметодом обратной Фазы спомощьюстолба "Уотерс См-Бондапак" всистеме вымывания 20 об,% ТЕАР (триметиламмониефосфатный буфер) в метаноле с соответствующими градиентамии скоростью потока 1,5-2,0 мл/мин, 137878540 Буферный раствор ТЕАР изготавливалипо методике Ривьера. Во многих случаях удовлетворительные результатыобеспечивали в системе 0,1 М НАс,рН 3, 20 об%, и 0,1 М НАс, рН 3в метаноле,Вытекающий поток, содержащий 11 ацилдипептиды, собирали вручную идоводили до сухости путем лиофилинзации или на установке Бюхи Рото Овап" при 35-45 С, Малые пробы остатков гидролизовали в б М НС 1 при110"С в вакууме в течение 36 ч, Испаренные гидролизаты анализировалина аминокислотном анализаторе типа15Даррум Л",Синтез со свободными аминокислотами в качестве аминовой компоненты.П р и м е р 1. 2 мл 0,6 М растворавалина 0,1 М КС 1, 1 М ЕНОТА при рН9,8 смешивают со 100 мкл (О, ммоль)1 М раствора Вг-А 3.а-ОМе (растворенныхв 967.-ном этаноле), Реакцию прово-,дят в рН-стате при 35 С и рН 9,8,причем значение рН поддерживают25постоянным путем автоматического добавления 0,5 М 1 ЫОН, Реакцию инициируют добавлением 0,7 мг карбоксипептидазы-У (150 О /мг, производство"Де форенеде Брижерье"), После протекания реакции в течение 30 мин, реакцию останавливают с помощью доведения рН до 1 при посредстве 6 М НС 1.Продукт реакции очищают и выделяютс помощью хроматографии при высоком 35давлении. Выход Вг-А 3.а-Ча 1-ОН составляет 40%. Количественный анализаминокислоты после гидролиза продукта в 6 М НСТ в течение 24 ч даетсоответственно 1,0 моль аланина и1,0 моль валинаВлияние рНтемпературы и концентрации субстратной компоненты, аминовой компоненты и СРЛ-У на выходВг-А 1 аа 1.-ОН+СН ОН изучали с помощью пяти серий экспериментов, проведенных аналогично описанной процедуре, В каждом из экспериментовизменяли один из указанных параметров при постоянстве остальных четы 50рех: 0,6 М валин; 55 ммоль Вг-А 1 а-ОМе;4,5 мкмоль СЮ-У; рН 9,7; 35 С. Полученные результаты показали, чтодиапазон оптимальных значений рНдовольно узок и составляет всего0,5 ед. рН, возрастание температуры .реакции приводит к почти линейномувозрастанию синтеза иэ-за относительно слабого гидролиза. При температурах выше 45 "С снижение активностифермента и неферментативный гидролиз эфиров становятся неприемлемы-ми. При более низких температурахпри рН до 10,0 гидролиз эфиров былпренебрежимо мал в течение 10 минреакции. Однако он становился существенным при снижении скорости ферментативной реакции, когда длитель"ность реакции возрастала до 2-5 ч.Выход Вг-А 3.аа 1-ОН увеличивалсяпри возрастании концентрацчи аминовой компоненты. Обратная зависимость наблюдалась между выходом иконцентрацией субстратной компонентыдля Вг-А 1 а-ОМе, Это обстоятельствос учетом зависимости выхода от высокой концентрации фермента гозволяетнайти оптимальное отношение субстрата к концентрации Фермента,В присутствии 0,5 М валина субстрат Вг-А 1.а-ОМе быстро преобразовывался (в течение 20 мин) в 38% Вг-Ы.а 7 а 1-ОН и 62% Вг-А 1 а-ОН. Эти цифры показывают также, что дипептид негидролизовался при рН 9,7 в присутствии избыточного валина. Если рНдоводили до 5-8, то весь Вг-А 3.а-,1 а -ОН гидролизовался за несколько секунд. Такое избирательное поведениеСРВ-У при высоких рН является свойством, имеющим важное значение присинтезе пептидов.П р и м е р 2. 2 мл раствора 3 Млизина, 0,1 М КС 1, 1 мМ ЕНОТА при рН9,8 смешивают с 400 мкл 100%-ногометанола и 100 мкл (0,1 ммоль) 1 М2-РЬе-ОМе (растворенного в 100%-номметаноле). Реакцию проводят аналогично примеру 1, ионизируя добавлением 0,7 мг карбоксипептидазы-У. Через 30 мин рН доводят до 1 с помощью 6 М НС 1. Продукт реакции очищаюти выделяют способом хроматографиивысокого давления, Выход РЬс-Ьуз-ОНдостигает 60%. Количественный анализ аминокислот, производившийся аналогично примеру 1, показал, что впродукте содержался 1 моль лизина и1 моль фенилаланина.Пептиды, представленные в табл.1,производили из указанных исходныхматериалов аналогично примерам 1 и2. Эксперименты выполняли в радиометрическом рН-стате, а выходы определяли на установке НРТ,С. Поддерживали значения: 4,5 мкМ СРЭ-У; рН9,7; 35 С.Синтез с амидами аминокислот нкачестве аминовой компоненты,П р и м е р 3. 2 мл раствора0,6 М метионинамида (Ме 1-ИНа), 0,1 МКС 3, 1 мМ К 1)ТА при рН 9,8 смешиваютсо 100 мкл (0,1 ммоль) раствора 1 МВг-А 3.а-ОМе в 96 Х-ном метаноле. Реакцию проводят аналогично примеру 1,инициируя добавлением 0,7 мг карбоксипептидазы-У. Через 30 мин посленачала реакции значение рН доводятдо 1 с помощью 6 М НС 1. Продукт реакции очищают и выделяют способомхроматографии высокого давления. Выход Вг-А 1 а-Ме 1-МНг 95 Х. Количественный аминокислотный анализ, проводившийся так же, как в примере 1, показал, что продукт содержал 1,0 мольА 3.а, 1,0 моль Ме 1 и 1,0 моль ИНВ течение 20 мин субстрат почтиполностью превращался в дипептид(95 Х), а 5 Х гидролизовалось до Вг-А 3.аОН.П р и м е р 4. 2 мл раствора 0,4 М 25налинамида (Ча 1-КН ), 0,1 М КС 1,1 мМ ЕРТА при рН 9,5 смешивают со100 мкл (0,1 ммоль) раствора 1 М ВгА 1 а-ОМе н 96 Х-ном метаноле. Реакциюпроводят, как в примере 1. Продукт 30реакции Вг-А 3 аа 1-ИНг осаждают новремя реакции, Через 20 мин после начала реакции рН доводят до 1 и осадок выделяют иентрифугированием.Продукт растворяют н 1 мл 96 Х-ного метаиола, очищают и выделяют способомхроматографии высокого давления. Выход Вг-А 1 а-Ча 1-11 Н составляет 95 Х,н то время как в примере 1 при использовании свободной аминокислоты в 40качестве аминоной компоненты, онбыл равен. только 40 Х, Количественный анализ аминокислоты, проводившийся так же, как н примере 1, показал,что продукт содержал 1,0 моль А 3.а,1,0 моль Ча 1 и 1,0 моль ИНз.Зависимость протекания реакции отзначения рН и от концентрации валинамида.Реакцию проводили аналогично описанному синтезу, причем постоянныепараметры составляли: 0,6 М валинамида; 55 мМ Вг-А 1 а-ОМе; 4,5 мкМ СРР-У;рН 9,7; 35 С.Полученные результаты показали,55что выход практически не зависит отконцентрации налинамида.Эффективное значение рН валинамида не превышает 9, значение рН 9,8 является верхним пределом, после которого выход сразу уменьшается,Аналогично примерам 3 и 4 пептиды, приведенные в табл. 2, приготавливают из указанных исходных материалов. Эксперименты выполняют вследующих условиях: 4 мкМ СРР-У;рН 9,6; 35 С. Концентрация субстрата приведена в табл. 2,П р. и м е р 5, Синтез с аминокислотными гидразидами в качестве аминовой компоненты.Аналогично примерам 3 и 4 пептиды, приведенные в табл,3 приготавли-. вали из указанных исходных материалов. Эксперименты проводили при 35 С, рН 9,6 н присутствии 4,5 мкМ ОРИ-У,П р и м е р б. Синтез с аминокислотными эфирами в качестве аминовой компоненты.Эксперименты с аминокислотными эфирами проводят так же, как в примерах 1-4: в радиометрическом рНо стате при рН от 9,0 до 9,7 и 23-35 С, Продукты и выход определяют с помощью НРЬС, Концентрация СРР-У состав" ляла от 4,5 до 11 мкМ.В табл. 4 приведены пептиды, получаемые из укаэанных исходных материалов, Видно, что н отдельных случаях имела место некоторая олигомериэация, Поскольку выходы обычно очень высоки, то аминокислотные эфиры можно считать пригодными для дальнейшего ограничения олигомериэации. П р и м е р 7, Ь- и Р-стереоизомеры в качестве аминовой компоненты,Пеитиды, приведенные в табл. 5,были получены иэ исходных продуктовтак же, как в примерах 1-4 и 6.Видно, что включаются только Ьизомеры. В результате процесс становится экономичным, поскольку исключается необходимость очистки исходныхаминокислот для получения чистогоЬ-иэомера.П р и м е р 8. Изменения субстратной эфирной группы.Пептиды, приведенные в табл. 6,были получены иэ указанных исходныхматериалов так же, как в примерах1-4.Результаты доказывают гибкостьпредлагаемого способа по отношениюк выбору субстратов,Пептиды, приведенные в табл. 16, 40 были получены так же, как в примерах1 и 3, при следующих условиях: 50 мМ субстрата, 0,25 мл геля СР-У (5 мкмоСРР-У); рН 9,7, 35 С. После удале" ния фермента путем фильтрации продукты и выходы определяли с помощью НРЬС. П р и м е р 18. Амиды пептидов вкачестве субстратон.Раствор 5 мл Вк-А 3.а-Ьеи-ИН 2 в0,10 М КСЬ, 1 мл ЕНТА в присутствии107.-ного диметилформамида при рНо10,0, 25 С смешивали с 0,25 М валинамида,Реакцию инициировали добавлением40 мМ СРР-У и проводили аналогичнопримерам 3 и 4, Вк-Ыа-Ьеи-Уа 1-ИН 2выделяли методом НРЬС с выходом порядка 653,7 137878П р и м е р 9. Лепсипептиды в качестве субстратов.Как н примерах 3 и 4, пептиды,приведенные в табл. 7 были получе у5ны из указанных исходных материаловПроцесс проводили н присутствии4,5 мкМ СР 1)-У при рН 7,6 25 С,Из табл. 7 видно, что обеспечиваются очень высокие выходы, 10П р и м е р 10, Пептиды н качестве субстратных компонент.Пептидн, приведенные в табл, 8,были получены так же, как в примерах1-4. Эксперименты проводили в радио 15метрическом рН-стате, выходы определяли с помощью НРЬС. Постоянно поддерживали следующие параметры: 4-25 мкМСР 1)-У, рН 7,6 при 25 С,Зависимость синтеза пептидов отрН.В тех случаях, когда синтезируемыепептиды являются неподходящими субстратами для СРП-У, синтез может выполняться при значениях рН предпочтительно 9-10,5,П р и м е р 11, Так же, как н примерах 1 и 3, пептиды, приведенные втабл. 9, были получены в рН-статепри указанных значениях рН.о 30Опыты проводили при 25 С в присутствии 15 мкмоль СР 1)-У.Лругие аминовые компоненты,П р и м е р 12, Пептиды, приведенные в табл. 10, были получены также, как в примерах 3 и 4. Эксперименты выполняли н рН-стате, выходы определяли с помощью НРЬС. Опыты проводили рН 4,5 мкМ СР 1)-У, рН 9,5, 25 С.П р и и е р 13. Синтез пептидовс ячменными карбоксипептидазами.Прорастающий ячмень, например,в ниде солода содержит две различныекарбоксипептидазы, обозначаемыеСР-1 и СР-1,СР-1 и СР-1 изолировали пометодике Рэн, пептиды, приведенныен табл. 11, были получены так же,как н примерах 1-4, из,указанных исходных материаловПоддерживали следующие условия: 6 мкМ СР-1 или 50СР-1, рН 8.0, 25 С,П р и м е р 14. Лиамидация пептидных амидов при катализе карбоксипептидазой.К 2 мп раствора 15 мМ Вк-Ыа-Ьеи 11 Н 2 в 0,1 М КС 1, 1 мМ ЕНОТА (рН 9,7,25 С) н 1 ОЕ-ном диметилформамидедобавляли 2 мг СРП-У. Результатыопределяли с помог(ью НРЬС, как в при 5 8мере 1. Видно, что Вг-АЗ.а-Ьеи-КН,через 20 мин полностью преобразовывался в 68/. Вк-А)а-Ьеп-ОН и 322Вк-А 3.а-ОН, Аминокислотный анализ среды реакции показал, что Вк-А 1 а-ОНобразуется главным образом в результате отщепления Ьеи-КН от Вг-А 1 а 2ЬецНП р и м е р 15, Сравнение пептидно-эфирных субстратов с И-концевымизащитными группами и без них,Так же, как в примерах 3 и 4, пептиды, приведенные н табл, 12,былиполучены н следующих условиях: 50 мМсубстрата, 5 мкМ СР 1)-У, рН 9,5, 25 С,П р и м е р 16, Синтез в присутствии органических растворителей,Так же, как н примерах 1-4 и 6,пептиды, приведенные в табл. 3-15,были получены из указанных исходныхматериалов при указанных концентрациях органических растворителей,Поддерживали следующие условия:5(1 мМ субстрата, 5 мкМ СРГ-У, рН 9,6,30 СП р и м е р 1, Нерастворимая"Конкавалин-А-Сефароза 4 В", выпускаемому фирмой "Фармациа Файн Кемикалз", после чего формировали перекрестные связи между СРБ-У и Конкавалином А с глутаральдегидом, какописано Хсиас и Ройером, Концентрация СР 1)-У составила 3 мг на расфасованную Сефарозу,1378/8 10 ВК - АГ 11 - ОЕ 1рн 9 6 СРВ УНуг - Н 2ВК-ДГ-тУ 1.-ж (И/.)рН 9 б СРВ - УВ 7 - АГ- Ту 1"-ОН (90%)ЕВОН / НС 1БХ - АГ 0 - ТУ 1"-Ое 1 (80/ЙрН 9,0 СР - УН - Яу-Ое.В, - Аг - Ту 1-С 1 у - О 1 у-Ое 1 (бО/о) ВХ - А 1-Ту ру-Иу-РЬе - ЮН (б 5/ )О Н - Туг - С 1 у-Яу - РЬе - ИеЪ - ОН (95/о)рН 3,0 Ч 1 ур 310ВК-Л 1 О-ту 1.-С 1 у - яУ - РЬе - не-ОН (75%).рЕ 1 9,5 СРП - УН-Ие 1 - ОНВк - Лг - Туг-С 1 у-Яу - РЬе - Ое 1 (80/о)ЕВОН/НС 1ВЕ-АГЦ - ТУ 1-С 1 у-С 1 у - РЬе - ОН (95%)рИ 9,5 сРВ -У 9Реакцию повторяли с использованием Бк-А 1 а-Р 11 а-ИН в качестве субст 2ратной компоненты. Вк-А 1 а-РЬе-Уа 1-ИНг выделяли методом НРС с выходом по 5 рядка 447 П р и м е р 19. Синтез мет-энкефалина. Стадии катализируемой СРБ-У конденсации и деамидирования проводили в чистой водной фазе, а Вг-Агя был выбран в качестве солюбилизирующей защитной группы, которая может быть удалена на последней стадии с помощью трипсина. После расширения пептида под воздействием амида амина кислоты с последующим деамидираванием, следующий пептидно-сложноэфирный субстрат синтезировали с помощью абсалютированного этанола и безводной НС 1. Прсле каждой стадии реагенты 45 выделяли методом препаративной НРЬС. Таким способом могут быть также регенерированы избыток аминной компоненты и побочные продукты гидролизаПредлагаемый способ позволяет упростить процесс ферментатинного получения пептидов за счет использования экзопеитидаз вместо применявшихся ранее ферментов, каждый из которых проявлял доминирующую или па мень шей мере значительную эндопептидазную активность, что позволяет расширить набор аминных и субстратных компонент, использовать ферментативный Ступенчатый синтез мет-энкефалина при использовании в качестве исходного вещества 5 г Бк-Агд-Ое 1 и в присутствии СРП-У в качестве катализатора проводили по следующей схеме: синтез мет-энкефалина с использованием в качестве катализатора СРу-У; выход для каждой стадии приведен в скобках,процесс для синтеза многазвенных биологически активных пептидов, например энкефалина, значительно сократитьиспользование защитных гругп, проводить стеноспецифический синтез, снизить расход фермента до концентрации2-25 мкмоль, проводить процесс вболее широком диапазоне рН 7,6-10,5)с получением стабильного высокоговыхода целевого продукта,Формула изобретения 1, Способ ферментативного получения пептидов общей формулы А-В, где А:И - концевой защищенный 1.-аминокислотный остаток или пептидный остаток состава-6 Ь-аминокислот, содержащий Б-аминокислоту на его С-терминальном конце и необязательно защитную группу на И-терминальном конце, В;1. - аминокислотный остаток, который может быть С-терминально защищен, путем взаимодействия аминокислотной и субстратной компонент в растворе в присутствии фермента, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,1378785 Таблица 1Синтез пептидов с катализацией карбоксипептидазой-У при использованиисвободных аминокислот в качестве аминовой компоненты Выход,Е(1,0 М) Вг-АЬа-Азр-ОН с целью упрощения процесса,в качестве субстратной компоненты используют компоненту, выбранную из группы, содержащей сложные эфиры аминоки 5 слот, сложные эфиры пептидов и депсипептидов Формулы А-ОР 1, где значения А указаны выше, Б, - С, -С 4-алкил, бензил или альфа-дезамино-Фрагмент 01 у, АХа или Рйе; амиды аминокислот или пептидов формулы А-ИН , где значения А указаны выше, пептиды формулы А,-Х, где А, - Ь-аминокислота или ди-пентапептид, Х - Ь-аминокислота, а в качестве аминной компоненты используют компоненту, выбранную из группы, содержащей аминокислоты общей формулы Н-В-ОН, где значения В указаны выше, амиды необязательно И-эамещенной аминокислоты формулы Н-Е-ИНН , где значения В указаны выше, Бз - водород, оксигруппа, амино, С-С 4-алкил, сложные эфиры аминокислоты формулы Н-В-ОБ 1, где значения В казаны выше Е - С -С -ал"4 1 4 кил, и процесс ведут в присутствии Ь специфического серии- или тиоалкилСубстрат (кон Аминовая компонентацентрация) (концентрация) карбоксипептидазного энзима, которыйвводят в реакционную массу в концентрации от 2 до 25 мкмоль, процессведут в водном растворе или дисперсии при рН 7,6-10,5, 25-45 С приисходной концентрации субстратнойкомпоненты 0,01-0,15 моль, аминнойкомпоненты, 0,05-3,000 моль с последующим выделением необязательно защищенного пептида, после чего в случае необходимости отщепляют группыБ з или Н 4 с помощью серинкарбоксипептидазного энзима,2, Способ по п. 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что в качествекарбоксипентидаэного энзима используют карбоксипептидазу-У иэ дрожжей,карбоксипептидаз СР- или СР-1из проростков ячменя,3. Способ по п. 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что используютводный раствор, содержащий 0-207 органического растворителя, выбранногоиз группы, состоящей из низшего алканола, диметилформамида или полиэтиленгликоля.(1,2 М) Вк-АЬап-ОН Метиловый эйир глутаминовой кислоты (1,0 М) Вк-А 1 ап(ОМе)-ОН 30 Изолейцин (0,15 М)Глутамин (0,5 М) 40 Вк-А 1 а-Не-ОН Вк-А 1 а-ОМе-ОМе (10 мМ)Лизин (1,5 М) з пептидов при использовании амаминовой компоненты; катализат амид (0,3 М)инамид (0,4 М)имер 4) Метионинамид (ОТаб окислотных амидов в - карбоксипептидазаг-А 1 ау-ИН2г-А 1 а-Бег-ИН2