Способ определения липазы

ОП ЕТЕНИ 0 Н АТЕНТ оп е шение делен вия н испо е- с е-А - С-Х КСЬ1 ми овышение чувтривает иссубстрата лиормулы ОСУДАРСТЕЕННЫЙ НОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯРИ ГКНТ СССР, (71) Берингер Маннхайм ГмбХ (РЕ) (72) Ульрих Нойманн, Мартина аннус и Ханс-Георг Батц ШЕ)(56),Неппщ Р. Ргое 1 яя апй ВП 1 у Ю. Иг 8 Ьг Ьрохудепдс МдсгошегЬой аког Яресйс ПегегшЫаТхоп оЙ 1 разе Асг.чдсу 1 п Яегцш . апй Рцойепа 1 Р 1 цЫ. С 1 пса 1 СЬешдяггу ч. 23, Р 3, 1977, р. 522-531.ЯЬЦегц Кцгоо 1 а, е 1. а 1. А. Юоче 1 апй Яппр 1 е Со 1 огыпейгс Аязау Еог " Бцшап Яегцш 1 Лразе. Л. ВосЬеш., ч. 81, Р 2, 1977, р, 361-369.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПАЗЫ (57) Изобретение относится к =налитической химии. Цель изобретения - повыИзобретение относит ческой химии и имеет о чение для клинической х мии, фармацевтической х пищевых продуктов. Цель изобретения - п вительности определения. Изобретение предусма пользование в качестве пазы соединение общей ф,801604167 чувствительности. Сп соб р -ия липазы посредством воздейста субстрат липазы с образованием хромогена предусматриваетзование субстрата общей формулы Х-СО-А-СО-У-СН-СН(У-К)-СН -Е-Кгде А - алкильная или алкиленовая группа с 2-12 С-атомами, К и К, которые могут быть одинаковыми или разными, каждый обозначает алкильную группу с 6-18 С-атомами, один иэ остатков К и Ктакже обозначает атом водорода, Х - реэоруфин, 6-метилреэоруфин, 4,6-диметилрезоруфин, 1,6-диметилрезоруфин, 8-этилрезоруфин и 8-бромрезоруфин и каждый 7 и 2 н зависимо друг от друга обозначают -Я- или -О-, 2 также обозначает -СИ-. Количество освобожденного ароматического гидроксильного или тиолового соединения непосредственно или после сочетания с подходящим хромогеном оптически определяют по получившейся окраске. 3 табл. н,ск,где А - алкильная или алкиленовая группа с 2-12 атомами углерода;метру, производят оценку, как указано в примере 22,Тестоспецифические параметры (ср.пример 23 и табл,: величина холостого опыта 0,4 мЕ/мин; чувствительность липазы 28 мЕ/мин на 100 мЕ/мин;коэФфициент корреляции 0,988,П р и м е р 30. 4-Метилрезоруфин.Получают из 7,5 г 2-метил"4-нитрозорезорцина, 4,2 г резорцина, 3,6 гпиролюзита, 4,3 мл серной кислоты,75 мл метанола, 4 г цинкового порошка и 18 мл 252-ного аммиака.ДС: К = 0,70 (этанол - ацетон2:1).П./715 (0,1 М буферный растворфосфата калия, рН 8,5)11 окс== 579 нм.2-Метил-нитрозорезорцин получаютпо немецкому патенту 23 11 574, А 1.П р и м е р 31, Сложный (4-метилумбиллифериловый) эфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-глутаровой кислоты,а). 2,75 г (5 ммоль) 7 а и 1 г(5 ммоль) 4-метилумбеллиферона растворяют в 30 мл тетрагидрофурана изатем добавляют 2 г (10 ммоль) дицнклогексилкарбодиимида и 0,15 гдиметиламино-пиридина. После 24-часового перемешивания при комнатной температуре Фильтруют и сгущают, Сырой продукт очищают Р 1 азЬ-хроматографиейДС: Н 1 = 0,40 (уксусный эфир -петролейный эфир 1:3),Ь). Эмульсию получают, как указанов примере 22, но вместо использованного там субстрата липазы применяют35 мг сложного (4-метилумбеллиферилового) эфира 1,2-дилаурил-рац-глицеро 3-глутаровой кислоты, растворенногов 1,7 мл п-пропанола,Реакцию наблюдают по флуорометрупри 25 С, а именно при длине волныовозбуждения 364 нм, ширине щели5 нм и длине волны излучения 448 нми ширине щели 10 нм,Тест-специфические параметры (ср,пример 23 и табл,1); величина холостого опыта 0,4 мЕ/мин; чувствительность липазы 28 мЕ/мин на 100 единиц/л; коэффициент корреляции 0,9942,П р и м е р 32, Сложный (р-нитротиофениловый) эфир 1,2-0-дилаурил-рацглицеро-глутаровой кислоты.Получение 32 е-Ь аналогично примерам 7 а-Ь.1 О15 2025 30 35 40 45 50 55 Получение аналогично примеру 1 а из 3 г (7,7 ммоль) 1-0-(2-метокси-октадецил)-2-0-метил-глицерина, 25 мл хлороформа, 1,8 мл пиридина, О,1 г диметиламинопиридина и 1,75 (15 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты. Выход1,5 г (39 Х),ДС: К = 0,68 (ВР 18, ацетон - этанол 1:2).Сложный (6-метилрезоруфиновый) эфир 1-0-(2-метокси-октадецил)-2-ометил-рац-глицеро-глутаровой кислоты.Ь). Получение аналогично примеру 1 Ь из 1,5 г (3 ммоль) 33 а и 1,5 мл хлористого оксалила.с). Получение аналогично примеру 2 с из 0,68 г (3 ммоль) 4-метилрес). Получение аналогично 1 с из 1,4 г (10 ммоль) р-нитротиофенола, 100 мл диметилформамида, 2,4 мл пиридина, О, 2 г диметиламинопиридинаи 32 Ь.ДС: К = 0,76 (уксусный эфир -гексан 1:4), й). В 27 мл дистиллированной водырастворяют при хорошем перемешивании следующие соединения: 4,83 мгдеоксихолата натрия; 28,00 мг СНЕЯ(циклогексиламино)-этан-сульфокислота, 17,50 г мочевины, 2,13 мг хлористого натрия, 0,16 мг колипазы свиньи,0,33 мг хлористого кальция, 152,00 мгтауродезоксихолата натрия,рН раствора 8,3. В этот растворпри хорошем перемешивании впрыскивают раствор сложного (р-нитротиофенилового) эфира 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-глутаровой кислоты. Затемраствор обрабатывали при охлаждении2 мин ультразвуком (средней интенсивности).В 1 мл полученного таким путемэмульсионного раствора добавляли50 мл пробы (содержащей липазу человеческой сыворотки) и смешивали. Реакцию наблюдали при 405 нм рт,ст,по Фотометру и проводили вычисление,как указано в примере 22,Тестоспецифические параметры: величина холостого опыта 0,3 мЕ/мин;чувствительность липазы 12,2 мЕ/минна 100 ед/л; коэффициент корреляции0,998.П р и м е р 33. а), Сложный моноэфир 1-0-(2-метокси-октадецил)-2-0-метил-рац-глицеро-глутаровой кислоты.21 160416 зоруфина, 0,45 мл 1,8-диазабицикло- -".фм (5,4,0)-ундец-ена и ЗЗЬДС: К = 0,86 (уксусный эфир).Й). Тест-эмульсию получают, как указано в примере 22, однако в качестве субстрата липазы используют сложный 6-метил-резоруфиновыйэфир 1-0- (2-метокси-октадецил)-2-0-метил-рацглицеро-глутаровой кислоты, 1 ООпределение концентрации липазы производят через калибровочную прямую из двух стандартов различной концентрации липазы, при которой изменение экстинкции за 1 мин наносят 15 относительно изменения экстинкции. Величина холостого опыта 8,4 мЕ/мин;чувствительность эстеразы 25,3 мЕ/мин,:чувствительность липазы 19,0 мЕ/минна 100 ед/л; коэффициенткорреляции0,9483.П р и м е р 34, а). Сложный моноэфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицероянтарной кислоты, 25Получение аналогично примеру 1 аиз 8,56 г (20 ммоль) 1,2-0-дилаурилглицерина, 4 г (40 ммоль) ангидридаянтарной кислоты, 60 мл хлороформа,4,6 мл пиридина и 0,24 г диметиламинопиридина. Продукт кристаллизуютиз гексана. Т.пл, 41-43 С.ДС: К 1 = 0,26 (уксусный эфир -гексан 1:4).Сложный резоруфиновый эфиР 1,2-0 дилаурил-рац-глицеро-янтарной кислоты,Ъ), Получение аналогично примеру17 из 2,65 г (5 ммоль) 34 а, 1,06 г(5 ммоль) резоруфина, 6,18 г (30 ммоль)40дициклогексилкарбодиимида, 0,1 г диметиламинопиридина и 50 мл диметилформамида,ДС: К 1 = 0,47 (уксусный эфир -петролейный эфир 1:3),45с), Получают эмульсию как указано в примере 22, однако в качествесубстрата липазы в этом случае применяют 70 мг сложного резоруфиновогоэфира 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-З 50янтарной кислоты, растворенного в1,7 мл п-пропанола.При этом получают следующие тестспецифические параметры (ср.пример 23и табл.1): величина холостого опыта3,8-4,0 мЕ/мин; чувствительность эс 55теразы не определена; чувствительность липазы 8,7 мЕ/мин на 100 ед/л;коэффициент корреляции 0,8793,7 22П р и м е р 35. а). Сложный моноэфир 2-О-лаурил-октадекандиол (1,2)-1 глутаровой кислоты,Получение аналогично примеру 1 аиз 4,6 г (10 ммоль) 2-О-лаурил-октадекандиола (1,2), 29 мл хлороформа,2,3 мл пиридина, 0,12 г диметиламинопиридина, 2,3 г (20 ммоль) ангидридаглутаровой кислоты.ДС: К= 0,54 (петролейный эфир -уксусный эфир 4:1)Сложный (Г-метилргзоруфиновый)эфир 2-О-лаурил-октадекандиол (1,2)-1 глутаровой кислоты.Ь)Получение аналогично примеру1 Ь.из 1,15 г (2 ммоль) 35 а и 0,88 млхлористого оксалила.с). Получение аналогично примеру2 с из 0,45 мл (2 ммоль) 4-метилрезоруфина, 20 мл хлороформа, 0,3 мл1,8-диазабицикло-(5,4,0)-ундецена, 40 мг диметиламинопиридинаи 35 Ъ,ДС: К = 0,37 (петролейный эфируксусный эфир 5:1).й). Получают эмульсию, как указано в примере 22, однако в качествесубстрата лиазы используют 70 мгсложного (6-метил-резоруфинового)эфира 2-0-лаурил-октадекандиол,21-глутаровой кислоты, растворенногов 1,7 мл п-пропанола.В соответствии с примером 23,табл,1 получают следующие тест-специфические параметры: величина холостого опыта 03-1,0 мЕ/мин; чувствительность эстеразы 1,0 мЕ/мин;чувствительность липазы 25,5 мЕ/мин вХна 100 ед/л., коэффициент корреляции 0,996,П р и м е р 36, а). Сложный моноэфир 1,2-0-дилаурил-рац-З-тиоглицеро 3-глутаровой кислоты.Получение аналогично примеру 1 аиз 2,5 г (4,8 ммоль)1,2-0-дилаурилрац-тиоглицерина 14 мл хлороформа,1 мл пиридина и 1,1 г (9,6 ммоль)ангидрида глутаровой кислоты.ДС: К 1 = 0,5 (гексан - тетрагидрофуран 1:4).Сложный (6-метилрезоруфиновый)эфир 1,2-0-дилаурил-рац-З-тиоглицеро8 глутаровой кислоты.Ь). Получение аналогично примеру 1 Ь из О, 74 г (1,3 ммоль) Зба иО,б мл хлористого оксалила.с). Получение аналогично примеру2 с из 0,3 г (1,3 ммоль) 4-метилрезо 16041 О 7руфина, 13 мл хлороформа, 0,2 мл1,8-диазобицикло-(5,4,0)-ундец-ена,27 мг диметиламинопиридина и 36 Ъ,ДС, К 1 = 0,38 (петролейный эфируксусный эфир 17:3).Использованный в качестве исходного вещества 1,2-0-дилаурил-рацтиоглицерин получают известным способом следующим образом.Превращение 1,2-0-дилаурилглицерина с хлорангидридом толуолсульфокислоты до дилаурил-глицеро-толуолсульфоната, затем реакция с тиомочевиной до соответствующей соли изотиоурония, последующий гидролиз с солянойкислотой,ДС: К= 0,52 (петролейный эАир -уксусный эфир 49:1).й). Получают эмульсию, как указано в примере 22, Однако вместо примененного там субстрата липазы используют раствор 70 мг сложного (6-метилрезоруАинового) зАира 1,2-0-дилаурилрац-тиоглицеро-Б-глутаровой кислоты в 1,7 мл п-пропанола,Тестоспецифические параметры: величина холостого опыта 0,2 -0,9 мЕ/мин; чувствительность эстеразы 1,3 мЕ/мин; чувствительность липазы 4,1 мЕ/мин на 100 ед/л коэфФициент корреляции 0,857.П р и м е р 37, а). Сложный моноэфир 1,2-Я-дилаурил-рац,2-дитиоглицеро-глутаровой кислоты.Получение аналогично примеру 1 аиз 3 г (6,5 ммоль) 1,2-Я-дилаурил 1,2-дитиоглицерина, 30 мл пиридина и 1,5 г (13 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.ДС: Ы = 0,43 (петролейный эфир -уксусньп": эфир 1:1),ДС. "КЕ = 0,37 (уксусный эфир -петролейный эфир 1:4),Сложный (6-метилрезоруфиновый)эфир 1,2-Я-дилаурил-рац,2-дитио"глицеро-глутаровой кислоты.Ь). Получение аналогично примеру 1 Ь из 1,2 г (2 ммоль) 37 а и 1 млхлористого оксалила,с). Получение аналогично примеру2 с из 0,46 г (2 ммоль) 4-метилрезоруфина, 20 мл хлороформа, 0,3 мл 1,8 диазабицикло-(5,4,0)-ундец-ена и37 Ь.Примененный в качестве исходноговещества 1,2-Я-дилаурил-рац,2-дитиоглицерин получают следующим образом. В раствор 9 г (160 ммоль)гидроокиси калия в 250 мл этанола закапываютпри комнатной температуре 10 г(80 ммоль) 2,3-димеркаптопропанола в 100 мл этанола. После одночасового перемешивания закапывают раствор 40 г (160 ммоль) додецилбромидав 100 мл этанола. Для дополнения реакции перемешивают еще два дня, затемфильтруют и фильтрат смешивают сольдом. После подкисления 2 н. соляной кислотой трижды экстрагируют простым эфиром, органическую Аазу сушати сгущают. Остаток очищают на колонне с силикагелем (растворитель:уксусный эфир - петролейный эфир 1:10),ДС: КЕ = 0,54 (уксусный эфир -.петролейный эфир 1:10),20 Й). Получают эмульсию, как указанов примере 22, Вместо использованноготам субстрата липазы применяют в этомслучае сложный (б-метилрезоруфиновый)эфир 1,2-Б-дилаурил-рац,2-дитио 25 глицеро-Б-глутаровой кислоты, 70 мг,растворенные в 1,7 мл п-пропанола.Холостой опыт 3 мЕ/мин; чувствительность эстеразы 3,4 мЕ/мин; чувствительность липазы 24 мЕ/мин; коэффи 30 пиент корреляции 0,9943,П р и м е р 38. 4,6-Диметилрезоруфиновый эфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-глутаровой кислоты,Указанное соединение получают аналогично примерам 7 а-с, используя Вкачестве исходного материала 2,4 г(10 ммоль) 4,б-диметилрезофурина,Тонкослойная хроматография: И0,63 (смесь уксусноэтилового эфира игексана в соотношении 1;2).П р и м е р 39. 8-Бром-резоруфиновый эфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-глутаровой кислоты.45 Указанное соединение получаютаналогично примерам 7 а-с, используяв качестве исходного материала 2,7 г(5 ммоль) 2-бромрезофурина,Тонкослойная хроматография М 50 О,б (смесь уксусноэтилового эфира игексана в соотношении 1:2)П р и м е р 40. 8-Этилреэоруфиновый эфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро 3-Глутаровой кислоты,Указанное соединение получаютаналогично примерам 7 а-с, используя в качестве исходного материала 1,2 г (5 ммоль) 2-этилрезоруфина.где35 2 г16Тонкослойная хроматография М0,51 (смесь уксусноэтилового эфира ипетролейного эфира в соотношении 1:3)П р и м е р 411,6-Диметилрезоруфиновый эфир 1,2-0-дилаурил-рац;глицеро-глутаровой кислоты.Укаэанное соединение получаютаналогично примерам 7 а-с, используя в качестве исходного материала1,2 (5 ммоль) 1,6-диметилрезоруфина.Тонкослойная хроматография: М0,73 (смесь уксусноэтилового и петролейного эфиров в соотношении 1;2).П р и м е р 42. 4,6-Диметилрезоруфин.Указанное соединение получают таким же образом, как это описано впримере 30, используя в качествеисходных материалов 60 г 2-метил 4-нитрозорезорцина, 43,5 г 2-метилрезорцина, 34 г двуокиси марганца,40 мл серной кислоты, 400 мл 252-ного раствора аммиака и 40 г цинковойпыли,УФ/Ч 1 Б (0,1 М калийфосфатный буферс рН 8,5): Ъас = 585 нм.П р и м е р 43. 2-Бромрезоруфин.Указанное соединение получаюттаким же образом, как это описанов примере 30, используя в качествеисходных материалов 19 г 4-бромрезор"цина, 14 г 4-нитрозорезорцина, 9,7 гдвуокиси марганца, 11,5 мл серной.кислоты, 115 мл 253-ного растворааммиака и 11,5 г цинковой пыли.УФ/ЧХБ (О,1 М калийнофосфатныйбуфер с рН 85):смаке= 576 нм.П р и м е р 44. 2-Этилрезоруфин.Указанное соединение получаюттаким же образом, как это описано впримере 30, используя в качестве исходных материалов 5 г 4-этил-нитрозорезорцина, 3,3 г резорцина, 3 гдвуокиси марганца, 3,4 мл сернойкислоты, 50 мл 25%-ного растворааммиака и 4 г цинковой пыли.УФ/ЧХЗ (0,1. М калийфосфатный буфер с рН 8,5):%ск 573 нм.П р и м е р 45, 1,6-Диметилрезоруфин,Указанное соединение получают таким же образом, как это описано в .. примере 30, используя в качестве исходиас материалов 7,2 г 3,5-диокситолуола, 7,7 г нитрозорезорцина,4,9 г двуокиси марганца, 6,8 мл сер-,04167 26ной кислоты, 60 мл 252-ного растворасерной кислоты и б г цинковой пыли,УФ/Ч 18 (0,1 И калийфосфатный буфер с рН 8,5):ма574 нм. Цветной тест на липазы М 2711,Результаты определения активности липазы с эамещенными резоруфиновьми производными по примерам 38-41представлены в табл,2. Сравнение корреляции способапо изобретению и известного по Курсока показано в табл.3.15Формула изобретенияСпособ определения липазы, предусматривающий взаимодействие аналита с субстратом липазы, приводящее 20 к образованию хромогена, с последующим определением результата оптическим методом, о т л и ч а ю щ и й с .ятем, что, с целью повышения чувстви. тельности, в качестве субстрата ис пользуют группу вег;еств общей формулыО 00 11ЯС-У-С-Л-(;-И,с-т-ЯИС-Е-В,А - алкильная или алкиленовая группы с 2-12 атомами углерода;К и К - одинаковые или различные, каждый обозначаеталкильную группу с 6-18 40 атомами углерода, причемодин из Е и К обозначает водород;Х - резоруфин, 6-метилрезоруфиновый остаток,. 4,6-ди метнлреэоруфин, 1,6-диметилреэоруфин, 8-этилре;зоруфин и 8-бромрезоруфин 1Уи Е - каждый независимо друг 50от друга означают -3 или -О-;Еа оптическйм методом определяют количество высвобожденного гидроксильного или тиолового соединения непосредственно или после сочетания с соответствующим хромогеном.(активность100 ед/л),мЕ/мин увствительость эстеазы (актив- ость0000 ед/л), мЕ/мин Пример 13,2 7,0 000 144,0 100 Т а б л и ц а 2При-Холостое мер , значение,мЕ/мин Чувствитель- Коэффициность к ли- ент коррепазе (актив- ляции Н ность1000 л),мЕ/мин Чувствительность к эатеразе (активность 20 к),мЕ/мин 0,1-0,2 0,6-1,0 0,2-0,5 0,1-0,4 38 39 40 41 7,43,2гз,г20,2 0,9 0,8 08 0,9927(9) 0,9889(12) 0,9843(12) 0,9950(2) Т а б л и ц а 3 Корреляция с эталоннымспособом (коэффициенткорреляции) Способ Нижний диапазон актив ности650 е/л Верхнийдиапазон активности400 е/л Предлага е. Иьй ИзвестньФ 0,860,804 0,870,768 Составитель И ПриваловаРедактор М. Недолуженко Техред М,Дидык Корректор А. Обручар Заказ 3395 Тираж 513 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 3 4 5 6 7 8 9 10 1 20 2 3,9-4,10,4-0,82, 4-3,02,0-2,82,4-3,02,1"2,40,5-1,00,6-1,00,11,3-2,09,8-11,9 112,5 33,6 30,2 23,6 34,8 27,88,7 6,7 1,8 48,79,5 2,2818,0422,186,960,94,685,741,80,979,813,2 Не определен 0,9639 0,9421 0,9815 0,9179 0,9636 0,9286 0,9155 0,9364 0,9830 0,9888 Оэ 9716К иК - одинаковые или разные, каждыйозначает алкильную группу сбатомами углерода, одиниз остатков К и К 1 такжеатом водорода;Х - резоруфин, б-метилрезоруфин,1,6"диметилрезоруфин, 8-этилрезоруфин, 8-бромрезоруфин; У и 2 - каждый независимо другот друга означают -8- или-О также -СНУ 9и оптическое определение по окраске количества освобожденного ароматического гидроксильного или тиолово" го соединения непосредственно, или после сочетания с подходящим хромо- геном.Для К и Кпредпочитают алкильные группы в противоположность ацильным группам, так как они не чувствительны к гидролизу.Примерами для К и/или К, являются остатки метила, этила, пропила, 25 бутила, пентила, гексила, гептила, октила, нонила, де 4 ила, ундецила, додецила, тетрадецила, гексадецила и октадецила как алкильные группы, а также соответствующие ацильные группы, как группы ацетила, пропионила, бутирила, валерила, капронила, каприла, капринила, лаурила, миристила, пальмитила и стеарила, олеила, крото- нила, линолила, фенила, бензила или октилфенила.35Далее предлагаемый субстрат липазы содержит остаток дикарбоновой кислоты СООН-А-СООН, в которой А имеет предпочтительно 3-7 С-атомов.10 Кислотами, образующими А, являются малоновая, янтарная, глутаровая, адипиновая, пимелиновая, пробковая азелаиновая, себациновая, нонандикарбоновая, декандикарбоновая и ундекандикарбоновая кислоты. Предпочитают кислоты от глутаровой кислоты до азелаиновой кислоты, которые соответствуют А с 3-7 С-атомами.Х может быть ароматическим оксиО или тиолсоединением, которое представляет хромофор или может быть переведено в красящее вещество лишь последовательной реакцией. Типичными при-. мерами являются фенол тиофенол, нафтол, тионафтол и их производные,а также хромогенные соединения, как остаток резоруфина, б-метилрезоруфин, 4,б-диметилрезоруфин, 1,6-диметилре-"ф зоруфин и 8-этилрезоруфин, и 8-бромрезоруфин, хлбрфенолового красного,индоксила или тиофлуоресцеина. Предпочитают хромофоры, которыеимеют небольшую полярность и являютсяжирорастворимыми. Однако при этомдолжна быть гарантирована еще водорастворимость.Жирорастворению названных хромофоров способствует подходящее замещение с алкильными группами, Так, дляостатка резоруфина оказались группыметила, диметила и этила, а также замещение с бромом.Соединения по изобретению являются новыми. Они имеют асимметрический центр и поэтому оптически активны. В качестве субстрата липазы можно применять как образующиеся приобычных методах получения рацематы,так и оптические изомеры.Субстраты липазы по изобретениюможно получать известными методами.Способ предусматривает использование в составе аналита реактива, предпочтительно содержащего, мг/мл: субстрат 0,05-10, дезоксихолат 2-50, колипаза 0,001-0,01, мочевина 1-100,11 аС 1 0,1-10, буфер 1-50, устанавливающие рН от б до 10,5 соответственно в пересчете на годный к употреблению раствор.Приведенные примеры иллюстрируюткак получение субстратов, так и способы определения липаэы с их использованием.П р и м е р 1, а) Сложный моноэфир 1,2-0-дигексил-рац-глицероглутаровой кислоты.В раствор 3,3 г (11,5 ммоль) 1,20-дигексил-глицерина в 30 мл хлороформа добавляют последовательно2,5 мл пиридина, на кончике шпателя4-диметиламинопиридин и 2,6 г(23 ммоль) ангидрида глутаровой гислоты. Смесь нагревают 10 ч при флегме и после охлаждения разбавляют200 мл хлороформа. Фазу хлороформавзбалтывают с 1 н, соляной кислотойи сушат, После отфильтровывания высушивающего вещества растворитель удаляют и остаток очищают на колоннес силикагелем (элюент: уксусныйэфир - петролейный эйир 1;1).ДС: И = 0,45 (уксусный эфир -петролейный эфир 1:2 + 1% ледянойуксусной кислоты),7 6ного перемешивания при комнатной температуре фильтруют и удаляют растворитель. Переработка аналогична приме.ру 1 с.ДС: ВХ = 0,66 (уксусньп эфир -гексан 1:1),П р и м е р 3а). Сложный моноэфир 1,2-0-диоктил-рац-глицеро-З-пимелиновой кислоты.Получение аналогично примеру 1 аиз 3,2 г (10 ммоль) 1,2-0-диоктилглицерина и 2,1 г (15 ммоль) ангидрида пимелиновой кислоты.ДС: ВХ = 0,61 (уксусный эфир -петролеиный эфир 1:1),1 К (см 1):(пленка):1740; 1710,Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0 диоктил-рац-глицеро-пимелиновойкислоты,Ь), Получение аналогично примеру 1 Ь из 2,2 г (4,7 ммоль) За.с). Получение аналогично примеру2 с иэ. 1 г (4,7 ммоль) резоруфина,0,7 мл 1,8-диазабицикло-(5,4,0)-ундец-ена и ЗЬ,ДС: КХ щ 0,78 (уксусный эфир -гексан 1:2).П р и м е р 4. а). Сложный моноэфир 1,2-0-диоктил-рац-глицеро-З-азелаиновой кислоты.1 30 Получение аналогично примеру 1 аиз 6,3 г (20 ммоль) 1,2-0-диоктилглицерина, 80 мл хлороформа, 5 млпиридина и 5,2 г (30 ммоль) ангидрида азелаиновой кислоты.Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0 диоктил-рац-глицеро-азелаиновойкислоты,Ь), Получение аналогично примеру 1 Ь из 3,2 г (6,5 ммоль) 4 а и3 мл хлористого оксалила.с), Получение аналогично примеру 2 с из 1,4 г (6,5 ммоль) резоруфина, 65 мл хлороформа, 1,1 мл 1,8 диазабицикло-(5,4,0)-ундец-енаи 4 Ь,ДС: ВХ = 0,86 (уксусный эфир -гексан 1:2)1 К (см " ):(пленка) 1762; 1736,П р и м е р 5. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дидецил-рац-глицероглутаровой кислоты.Получение аналогично примеру 1 аиз 3,7 г (1 О ммоль) 1,2-0-дидецилглицерина, 40 мл хлороформа, 2,5 млпиридина и 1,8 г (15,8 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты,50 5 160416Сложный резоруфиновый эфир 1,2"0 дигексил-рац-глицеро-глутаровойкислоты,Ь ) 1,4 г (3,7 ммоль)раствора5по способу 1 а растворяют в 20 мл хлороформа и при охлаждении льдом закапывают 2 мл (23,3 ммоль) хлористогооксалила. Ледяную ванну удаляют и перемешивают раствор 12 ч при комнатнойтемпературе. Затем сливают растворитель, остаток поглощают в толуолеи снова выпаривают. Полученное таким путем масло применяют без дальнейшей очистки. 15с) 0,8 г (3,7 ммоль) резоруфинасуспендируют в 40 мл диметилформамида при добавке 1,1 мл пиридина ина кончике шпателя 4-диметиламинопиридина. Туда закапывают раствор по способу 1 Ь в 20 мл диметилформамида.После одно - и двухсуточного перемешивания при комнатной температуреФильтруют и сливают растворитель.Остаток поглощают в уксусном эфире, 25отфильтровывают нерастворимые компоненты и взбалтывают фильтрат с 1 н.соляной кислотой, затем с водой.После сушки органической фазы и отгонки растворителя получают маслянистый остаток, который очищают хроматографией на колонне с силикагелем (элюент: уксусный эфир - петролейный эфир 1:1)ДС: ВХ = 0,70 (уксусный эфир -гексан 1:1), .П р и м е р 2, а). Сложный моноэфир 1,2-0-диоктнл-рац-глицеро-Зглутаровой кислоты,Получение аналогично примеру 1 а 40из 3 г (41 ммоль) 1,2-0-диоктил-глицерина, 150 мл хлороФорма, 10 мл пиридина и 6,8 г (59,5 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты, Выход 6,5 г(373).45ДС: ВХ = 0,31 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:1),Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0 диоктил-рац-глицеро-глутаровойкислоты,Ъ). Получение аналогично примеру1 Ь из 2 г (4,5 ммоль) по примеру 2 а.с), 0,96 г (4,5 ммоль) резоруфинарастворяют в 50 мл хлороформа придобавке 0 75 мл (5 ммоль) 1 8-диаза 955бицикло-(5,4,0)-ундец-ена и 0,1 г4-диметиламинопиридина. Туда закапывают раствор по примеру 2 Ь в 20 млхлороформа. После одно- и двухднев 160416725 ДС: Кй0,77 (уксусный эфир -гексан 1:2).Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0 дидецил-рац-глицеро-глутаровой5кислоты.Ь). Получение аналогично примеру 1 Ь из 2,5 г (5 ммоль) 5 а, 50 мл хлороформа и 2,2 мл хлористого оксалила.с). Получение аналогично примеру 2 с из 1,1 г (5 ммоль) резоруфина, 1 мл 1,8-диазабицикло-(5,4,0)ундец-ена и 5 Ь,ДС: ВХ = 0,70 (уксусный эфир -гексан 1:1).15П р и м е р б. а). Сложный моноэфир 1,2-0"диундецил-рац-глицероглутаровой кислоты,Получение аналогично примеру 1 аиз 2 г 5 ммоль ) 1,2"0-диундецилглицерина, 25 мл хлороформа, 1,4 млпиридина и 0,9 г(7,5 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.ДС: И = 0,55 (уксусный эфир -петролейный эфир 1:2).1 К (см );(пленка) 1740 1710,Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0 диундецил-рац-глицеро-глутаровойкислоты,Ъ), Получение аналогично примеру 1 Ь из 2 г (3,9 ммоль) ба 5 млхлороформа и 1,8 хлористого оксалила.с), Получение аналогично примеру 2 с из 0,83 г (3,9 ммоль) резоруФина, 0,61 мл 1,8-диазабицикло-(5,4,О)-ундец"ена и 6 Ь,ДС: Ы ф 0,47 (КР 18, этанол "ацетон 2:1).П р и м е р 7. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-Зглутаровой кислоты,Получение аналогично примеру 1 аиз 10,7 г (25 ммоль) 1,2-0-дилаурилглицерина, 70 мл хлороформа, 5,5 пиридина и 3,3 г (29 ммоль) ангидрида 45глутаровой кислоты.ДС: КК = 0,33 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:1).1 К(см)(пленка): 1741; 1 708,Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0 дилаурил-рац-глицеро-глутаровойкислоты.Ь), Получение аналогично примеру 1 Ь из 5,5 г (10 ммоль) 7 а, 50 млхлороформа и 4,3 мл хлористого оксалила.с 7; Получение аналогично примеру2 с из 2,2 г (10 ммоль) резоруфина,100 мл хлороформа и 1,5 ил 1,8-диазабицикло-(5,4,0)-ундец-ена и 7 Ь. ДС: ВХ = 0,78 (уксусный эфир 7 йетролейный эфир 1 1).1 К (см-)(пленка): 1765; 1720.П р и м е р 8. а). Сложный моно- эфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-З- пимелиновой кислоты.Получение аналогично примеру 1 а из 8,6 г (20 ммоль) 1,2-0-дилаурил-глицерина, 50 мл хлороформа, 15 мл пири- дина и 4,3 г (30 ммоль) ангидрида пимелиновой кислоты. ДС: КХ = 0,5 (уксусный эфир -петролейный эфир 1:2).1 К (см )(пленка): 1740; 1710,Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0 дилаурил-рац-глицеро-пимелиновойкислоты,Ь), Получение аналогично примеру1 Ъ из 1,66 г (3 ммоль) Яа и 1,3 млхлористого оксалила,с). Получение аналогично примеру2 с из 0,65 г (3 ммоль) резоруфина,30 мл хлороформа, 0,5 мл 1,8-диазабнцикло-(5,4,0)-ундец-ена и 8 Ъ.ДС: Ы = 0,75 (уксусный эфир -гексан 1:1).1 К (см )(пленка): 1768; 1739.П р и м е р 9. а), Сложный моно- "эфир 1,2-0-дитетрадецил-рац-глицеро 3-глутаровой кислоты.Получение аналогично примеру 1 аиз 14,6 г (30 .ммоль) 1,2-0-дитетрадецил-глицерина, 150 мл хлороформа,8,2 мл пиридина и 5,1 г (45 ммоль)ангидрида глутаровой кислоты,ДС: КХ = 0,42 (уксусный эфир -петролейный эфир 1:2).1 К (см ) (КВг): 1740;. 1710,Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0 дитетрадецил-рац-глицеро-глутаровойкислоты,Ь). Получение аналогично примеру 1 Ь из 3 г (5 ммоль) 9 а и 2,2 млхлористого оксалила.с). Получение аналогично примеру2 с из 1,06 г (5 ммоль) резоруфина,50 мл хлороформа, 0,75 мл 1,8-диазабицикло-(5,4,0)-ундец-ена и 9 Ь,ДС: И = 0,34 (КР 18, ацетонитрил -дихлорметан 1:1),1 К (см )(КВг)", 1763 ф, 1735,П р и м е р 10. а). Сложный моноэфир 1,2-0- дитетрадецил"рац-глицеро 3-пимелиновог. кйслоты,Получение аналогично примеру 9 аиз 6,4 г (45 ммоль) ангидрида пимелиновой кислоты.91ДС: КЕ = 0,45 (уксусный эфир -петролейный эфир 1:2).1 К (см )(пленка): 1740; 1708,Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0 дитетрадецил-рац-глицеро-пимелиновой кислоты,Ь). Получение аналогично примеру1 Ь из 3,1 г (5 ммоль) 10 а и 2,2 млхлористого оксалила.с). Получение аналогично примеру 2 с из 1,06 г (5 ммоль) резоруфина, 50 мл хлороформа и 0,78 мл 1,8 диазабицикло-(5,4,0)-ундец-енаи 10 Ъ.ДС: М = 0,71 (уксусный эфир -петролейный эАир 1:2)1 К (см )(пленка): 1755; 1734.П р и м е р 11. а), Сложный моноэАир 1,2-0-дигексадецил-Бп-глицеро глутаровой кислоты,Получение аналогично примеру1 а из 2,7 г (5 ммоль) 1,2-0-дигексадецил-Яп-глицерина, 50 мл хлороформа, 3 мл пиридина и 1,5 г (13 ммоль)ангидрида глутаровой кислоты,ДС: Ы = 0,65 (уксусный эфир -петролеиный эфир 1:1)1 К (см )(Квг);, 1740; 1710,Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0 дигексадецил-Яп-глицеро-глутаровойкислоты,Ъ), Получение аналогично примеру1 Ь из 2,2 г (3,3 ммоль) 11 а и 1 млхлористого оксалила,с). Получение аналогично примеру 1 с из 0,71 г (3,3 ммоль) резоруфина, 20 мл диметилАормамида, 0,5 млпиридина и 11 Ь.ДС: М = 0,72 (уксусный эфир -петролейный эАир 1:2),П р и м е р 12, а). Сложный моноэфир 1,2-0-дибензил-рац-глицеро-Зглутаровой кислоты,Получение аналогично примеру 1 аиз 3 г (11 ммоль) 1,2-0-дибензилглицерина, 30 мл хлороАорма, 2,5 мппиридина и 1,8 г (16 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.ДС: И = 0,39 (уксусный эфир -петролейный эфир 1:1 + 1 ледянойуксусной кислоты).Сложный резоруфиновый эфир 1, 2-0 дибензил-рац-глицеро-глутаровойкислоты,Ь) . Получение аналогично примеру1 Ь из 2,9 г (7,5 ммоль 12 а), 30 мпхлороформа и 3,3 мп хлористого оксалила. 604167 Ос), Получение аналогично примеру2 с иэ 1,6 г (7,5 ммоль) резоруфина,75 мл хлороформа, 1,2 мп 1,8 диазабицикло-(5,4,0)-ундец-ена и 12 Ь.ДС: М = 0,48 (уксусный эфиргексан 1: 1) .П р и м е р 13. а). Сложный моноэфир 1-0-октадецил-0-бензил-Бпглицеро-глутаровой кислоты.Получение аналогично примеру 1 аиз 2,2 г (15 ммоль 1-0-октадецилО-бензил-Яп-глицерина, 50 мп хлороформа, 3 мп пиридина и 1,5 г (13 ммоль)ангидрида глутаровой кислоты.1 К (см ) (пленка): 1730; 1700.Сложный резоруфиновый эфир 1-0 октадецил-О-б ензил-Яп-глицероглутаровой кислоты,20 Ъ). Получение аналогично примеру1 Ь из 1,7 г (3,1 ммоль) 1 За и 1,3 млхлористого оксалила.с). Получение аналогично примеру1 с из 0,8 г (37 ммоль) резоруфина,25 20 мл диметилформамида, 0,7 мл пиридина и 13 Ь.ДС: Ы = 0,68 (уксусный эфир -петролейный эфир 1:1),К (см )(КВг); 1768; 1739,30 П р и м е р 14, а). Сложный моноэфир 1,2-диоктаноил-Бп-глицеро-З-глутаровой кислоты.Получение аналогично примеру 1 аиз 6,8 г (20 ммоль) 1,2-диоктаноилБп-глицерина, 100 мл хлороАорма,12,5 мл пиридина и 5,8 г (50 ммоль)ангидрида глутаровой кислоты,ДС: И = 0,49 (уксусный эАир -петролейный зАир 1:1).40 Сложный резоруАиновый эАир 1,2 диоктаноил-Бп-глицеро-глутаровойкислотыЬ). Получение аналогично примеру 1 Ь из 2,2 г (5 ммоль) 14 а и 2,2 мл45 хлористого оксалила.с). Получение аналогично примеру1 с из 1,05 г (5 ммоль) резоруАина,30 мл диметилАормамида, 0,75 мл пиридина и 14 Ь.ДС: КЕ = 0,86 (КР 18, ацетонитрил -дихлорметан 1:2).П р и м е р 15, а). Сложный моноэфир 1,2-диолеил-рац-глицеро-З-глутаровой кислоты.Получение аналогично примеру 1 аиз 3,1 г (5 ммоль) диолеина, 40 млхлороформа, 3 мл пиридина и 1,5 г7 12П р и м е р 18. Получение сложногомоноэфира 1,2-0-диоктил-З-пимелиновой кислоты,Стадия 1: синтез сложного бензилового моноэфира пимелиновой кислоты,Стадия 2: аналогично примеру 1 Ьиз 2,5 г (10 ммоль) сложного бензилового эйира пимелиновой кислоты;полученное масло закапывают в раствор 3,2 г (10 ммоль) 1,2-0-диоктилглицерина, 7 мл пиридина; обработка аналогично примь.1 с.Стадия 3: указанный продукт растворяют в 20 мл тетрагидрофурана ипосле добавки 0,4 г палладия - активированного угля гидрируют. Сыройпродукт очищают на колонне с силикагелем; растворитель уксусный эфир -петролейный эйир 1:1,ДС: РГ = 0,61 (уксусный эд;ир -петролейный эйир 1:1)1 К (см)(пленка): 1740; 1710,П р и м е р 19, Синтез сложногомоноэфира 1,2-диолеил-глицеро-З-глутаровой кислоты,а). Сложный трихлорэтиловый эфир1,2-0-изопропилиден-глицеро-З-глутаровой кислоты.Стадия 1; 5,55 г (42 ммоль) изопропилиденглицерина и 12 г (45,3 ммоль)2,2,2-трихлорэтил-гидро-глутаратарастворяют в простом диметиловомэйире этиленгликоля и смешиваютс 10,5 г (51 ммоль)дициклогексилкарбодиимида; после двухдневного перемешивания. фильтруют и подвергают перегонке", т.кип 170 С (0,1 торр),бесцветное масло.ДС: РЕ = 0,82 (ацетон - хлоройорм1:1).Стадия 2: полученное масло растворяют в 11 мл простого эйира, смешивают с 3 мл метанола и 3 мл 3 н, соляной кислоты и перемешивают 12 ч прикомнатной температуре; органическуюфазу встряхивают с насьпценным раствором бикарбоната натрия, затем с насьшенным раствором хлористого натрияи сушат; после удаления растворителяостается маслянистый остаток.ДС: Ы = 0,23 (уксусный эйир - петролейный эфир 1:1).Ъ) . Сложный трихлорэтиловый эфир1,2-диолеил-глицеро-З-глутаровойкислоты.Стадия 3; 6,1 г (18 ммоль) полученного продукта и 7,84 г (38 ммоль)олеиновой кислоты растворяют в 11 160416ДС: Ы0,32 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:1).1 К (см )(пленка): 1740; 1706.Диолеин можно получать в чистойформе из технического диолеина хро"матографией на колонне с силикагелем при использовании уксусного эйира - петролейного эфира 1:3 в качестве растворителя. 10Сложный резоруфиновый эфир 1,2 диолеил-рац-глицеро-глутаровойкислоты,Ь), Получение аналогично примеру1 Ь из 3,5 г (4,8 ммоль) 15 а и 1,3 мл 5хлористого оксалила.с), Получение аналогично примеру1 с из 0,9 г (4,2 ммоль) резоруйина,20 мл диметилформамида, 1 мл пиридина 15 Ъ. 20ДС: М = 0,78 (уксусный эйир -петролейный эфир 1:1).П р и м е р 16. Сложный нафтиловый эфир 1,2-0-дитетрадецил-рацглицеропимелиновой кислоты. 25Получение осуществляют аналогично примеру 10 Ь и с из 0,72 г(5 ммоль) 1-найтола. Очистка Р 1 азЬхроматографией на силикагеле с растворителем уксусным эфиром - гексаном 1:3.ДС: Ы = 0,89 (уксусный эфир -петролейный эфир 1:5).П р и м е р 17. Сложный резоруйиновый эйир 1,2-диолеил-рац-глицеро 3-глутаровой кислоты.10,3 г (14,2 ммоль) сложного моноэйира 1,2-диолеил-глицеро-глутаровой кислоты по примеру 15 а,3,2 г (15 ммоль) резоруфина, 6,2 г 40(30 ммоль) дициклогексилкарбодиимида и на кончике шпателя 4-диметиламинопиридин перемешивают в 75 млдиметилйормамида 2-3 дня при комнатной температуре. Затем разбавляютуксусным эйиром и осадок отйильтровывают. Фазу уксусного эфира взбалтывают с 1 н, соляной кислотой и сушат иад сульфатом натрия. После отгонки растворителя остается маслянистый остаток, который очищают хроматографией на колонне с силикагелем(растворитель:уксусный эфир - петролейный эфир 1:1).Таким образом получают соответствующее производное хлорйеноловогокрасного.ДС: И = 0,69 (БР 18; изопропанол -метанол 1:2).13160416100 мл простого диметилового эфираэтиленгликоля и закапывают раствор10,5 г (37 ммоль)дициклогексилкарбодиимида в 50 мл простого димети 5лового эфира этиленгликоля; после12-часового перемешивания при комнатной температуре фильтруют и последовательно встряхивают с 3 н. соляной кислотой е раствором бикарбоната Онатрия, затем с водой. После сушки иконцентрирования органической фазыостаток хроматографируют на силикагеле.Стадия 4: сложныи моноэфир 1,2- 5диолеил-глицеро-глутаровой кислоты;отщепление защитной группы трихлорэтила осуществляют известным методом,Г р и м е р 20. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дидецил-рац-глицеро-Зпимелиновой кислоты.Получение аналогично примеру 1 аиз 5,6 г (15 ммоль) 1,2-0-дидецилглицерина, 100 мл хлороформа, 3,2 млпиридина и 4,0 г (28 ммоль) ангидрида пимелиновой кислоты,ДС: Ы = 0,36 (уксусный эфир -гексан 1:1).1 К (см )(пленка): 1735; 1710. 30 Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0 дидецил-рац-глицеро-пимелиновойкислоты,Ь). Получение аналогично примеру 351 Ь из 3 г (5,8 ммоль) 20 а, 50 мл хлороформа и 2,2 мл хлористого оксалила.с), Получение аналогично примеру 2 с из 1,1 г (5 ммоль) резоруфина, 1 мл (6,4 ммоль) 1, 8-диазабицикло-(5,4,0)-ундец-ена и 20 Ъ.ДС: КХ = 0,71 (уксусный эфир -гексан 1:1),1 В, (см )(пленка): 1755; 1720,45П р и м е р 21, а). Сложный моно- эфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-З- азелаиновой кислоты,7 4Получение аналогично примеру 1 аиз 6,7 г (15,6 ммоль) 1,2-0-дилаурилглицерина, 100 мл хлороформа, 3,2 млпиридина и 4,0 г (23 ммоль) ангидрида азелаиновой кислоты,ДС: М = 0,22 (уксусный эфир -гексан 1:1)1 В. (см )(пленка): 1738; 1710,Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0 дилаурил-рац-глицеро-азелаиновойкислоты,Ь). Получение аналогично примеру1 Ь из 1,5 г (2,5 ммоль) 2 а ЗО млхлороформа и 1,5 мл хлористого оксалила.с). Получение аналогично примеру2 с из 0,55 г (2,5 ммоль) резоруфина, 25 мл хлороформа, 0,5 мл(3,2 ммоль) 1,8-диазабицикло-(5,4,0)ундец-ена и 21 ЪДС: М = 0,78 (уксусный эфир -гексан 1:1).1 К (см )(пленка): 1762; 1740.П р и м е р 22, 60 мл дистиллированной воды растворяют при перемешивании 1,2 г дезоксихолата натрияи 0,15 мл колипазы (от свиньи), Присильном перемешивании впрыскиваюттуда по возможности тонкой струей70 мг субстрата липазы сложного резоруфинового эфира 1,2-0 в диоктилрац-глицеро-азелаиновой кислоты(пример 4) в 1,7 мл п-пропанола придавлении. Раствор, который в 200 млдистиллированной воды содержит врастворенном виде 1,5 г мочевины,1 г дезоксихолата натрия, 200 мгхлористого натрия, 800 мг ТК 18 и107 мг ТК 18 - НС 1 буфера, хорошо смешивают с полученной выше эмульсией.2,5 мл изготовленного таким путемраствора смешивают с 100 мл пробы(сыворотка). Реакцию проводят при578 мм рт.ст. с показаниями на фотометре,При известной по стандарту активности липазы вычисляют активностьлипазы пробы следующим образом:Вычисление активности липазы пробы возможно также по следующей формуле:активность, ,(ед,/1) =(стандарт)Ь Е/мингде Чэ - общий подъем испытывае-"змой исходной смеси, см55з.Ч пробы - объем пробы, смЯ - коэффициент экстинкциихромогена при 578 нм;Й - толщина слоя кюветы,см;)0,82 г хлористого натрия, 2,7 гТК 18 и 0,4 г ТК 18 НС 1 растворяют в200 мл дистиллированной воды, Приперемешивачии впрыскивают раствор,который содержит в растворенной Форме 0,35 г сложного нафтолового эфира 1,2-0-дитетрадецил-рац-глицеропимелинавой кислоты в 7 мл пропанола, Полученную таким путем эмульсию замораживают при -40 С и подвергают лиофилизации,70 г полученного лиофилизата растворяют в 2 мл дистиллированной воды 50 160416ЬЕ/мин - изменение экстинкцииза 1 мин при 578 нм.При названных условиях реакциикоэффициент экстинкции составляетЯ = 60,65 смфмкмоль-1 5П р и м е р 23. Для различныхсубстратов липазы определены изменения величины холостого опыта, чувствительность эстеразы и липазы и корреляция к нефелометрическому тестус помутнением.Изменение величины холостого опыта определено с реактивом по примеру 1 и различными субстратами липазы.Вместо пробы добавляли 100 мл водыи наблюдали по фотометру изменениеэкстинкции при 578 (мЕ/мин).Для определения чувствительностиэстеразы добавляли вместо пробы 20100 мл карбоксилэстеразы (ЕС 3,1,1.1,около 20000 ед/л Берингер МаннхаймГмбХ, номер определения 10 46 98)и наблюдали, как описано выше, изменение экстинкции. 25Для определения чувствительностилипазы вместо пробы добавляли100 мл липазы (ЕС 3.1.1,3, около100 ед/л, Берингер Маннхайм ГмбХ,номер определения .41 45 90) и наблюдали, как описано выше, изменениеэкстинкции,Для определения корреляции к нефелометрическому тесту с помутнением проводили с возрастающими количествами липазы (0-1000 ед/л) тест35с помутнением (Берингер МаннхаймГмбХ, номер определения 26 23 58),сравнивали с цветным тестом по примеру 22 и определяли коэффициенткорраляцииРезультаты показаны в табл,1,7 16и смешивают с 100 мл ТК-растворакрасного паранитроанилина (красныйпаранитроанилин-хлор-метилбензолдиазоний-нафталин,5-дисульфонат) (231 мг в 10 мл дистиллированной воды).После добавки 100 мл сывороткинаблюдают за реакцией при 405 нм пофотометру.Определение концентрации липазыпроводят по калибровочной кривой аналогично примеру 22.П р и м е р 25. В раствор 3,04 гтауродезоксихолата, 2,7 г поливоска4000, 7 мг хлористого кальция, 0,2 мгколипазы (от свиньи) в 120 мл дистиллированной воды впрыскивают при перемешивании 150 мг субстрата липазысложного резоруфинового эфира 1,2-0 дидецил-рац-глицеро-глутаровойкислоты в 3,5 мл п-пропанола.К полученной таким путем эмульсиидобавляют следующий раствор и хорошосмешивают.10 г тауродезоксихолата, 6,4 гполивоска, 50 г маннита, 14 г мочевины, 800 мг хлористого натрия и 15 гТРИС растворяют в 300 мл дистиллированной воды. При помощи раствора соляной кислоты устанавливают рН 7,5, После этого раствор дополняют до 400 млдистиллированной водой,2,5 мл полученной таким путем реакционной смеси смешивают с 100 млсыворотки. Реакцию наблюдают при578 чм по фотометру.Оценку проводят, как в примере 22,П р и м е р 26, В раствор 3,04 гтауродезоксихолата, 2,7 г поливоска4000, 7 мг хлористого кальция,0,2 мг колипазы (от свиньи) в 120 млдистиллированной воды впрыскиваютпри перемешивании 150 мг субстраталипазы сложного резоруфинового эфира 1,2-0-дидецил-рац-глицеро-глутаровой кислоты в 3,5 мл п-пропанола,К полученной таким путем эмульсии добавляют и хорошо перемешивают следующий раствор.10 г тауродезоксихолата, 6,4 поли- воска, 50 г .маннита, 14 г мочевины, 800 мг хлористого натрия, 28 г буферного раствора СНЕБ в 300 мл дистиллированной воды. При помощи раствора соляной кислоты устанавливают рН 8,5. После этого дополняют раствор до 400 мл дистиллированной водой.2,5 мл полученной таким путем реакционной смеси смешивают с 100 мл сыворотки. Реакцию наблюдают при 58 нмпо фотометру.Оценку производят, как указанов примере 22.П р и м е р 27. В раствор из 4,0 гтауродезоксихолата Иа, 0,06 г хлористого кальция, 0,2 мг колипазы (отсвиньи), 5,0 г маннита и 2,0 г поливоска 4000 в 100 мл дистиллированнойводы впрыскивают при перемешивании150 мл сложного нафтолового эфира1,2-0-дитетрадецил-рац-глицеро-З-пимелиновой кислоты, который растворенв 4 мл и-пропанола. При хорошем охлаждении полученную таким путемэмульсию обрабатывают несколько минут ультразвуком.Второй раствор содержит в 100 мл2,4 г тауродезоксихолата Иа, 2,0 гТК 18, 12,0 г маннита, 3,5 г мочевиныи 0,5 г хлористого натрия. При помощи соляной кислоты устанавливают рН8,3.Третий раствор содержит 1 г красного паранитроаналина ТК (красный паранитроаналин ТК 4-хлор-метил-бензол-,диазоний-нафталин,5-дисульфонат) в40 мл дистиллированной воды в растворенной форме,5 ч. раствора 1 и 6 ч. раствора2 смешивают сч. раствора 3. Полученным раствором пропитывают пригодную для получения тест-полоски всасывающую бумагу, например, сорта,78532 фирмы Шляйхер унд Шулл и осторожно сушат в камерной сушилке с цир, куляцией воздуха при температуре от30 до 65 С.До дальнейшего применения рекомендуется хранение в присутствии средствадегидратации. Для испытания на липазу сыворотки .небольшое количество (несколько капель) ее наносят на полоску.На основании кривой скрашивания в желтый цвет по времени можно сделать вывод об активности липазы исследуемой пробы.П р и м е р 28. а). Сложный моно- эфир 1,2-0"дилаурил-рац-глицеро- тетрадекандикислоты.Получение аналогично примеру 1 а из 8,6 г (20 ммоль) 1,2-0-дилаурил-, глицерина, 100 мл хлороформа, 4 мл пиридина, 0,4 г диметиламинопириди 5 1 О 15 20 25 30 35 40 45 50 на, 9,6 г (40 ммоль) ангидрида двухосновнсй тетрадекановой кислоты.ДС: К 1 = 0,45 (уксусный эфир -петролейный эфир 1:5),Сложный (6-метилрезоруфиновый)эфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-Зтетрадекановой дикислоты.Ь). Получение аналогично примеру 1 Ь из 3,35 г (5 ммоль) 28 а и2,2 мл хлористого оксалила.с)Получение аналогично примеру2 с из 1,2 г (5 ммоль) 4-метилрезоруфина, 20 мл хлороформа, 0,75 мл 1,8 диазабицикло-(5,4,0)-ундец-ена,0,1 г диметиламинопиридина и 28 Ь.ДС: К= 0,63 (уксусный эфир -гексал 1:4).Й), Получают эмульсию, как указано в примере 22. Однако вместо названного субстрата липазы применяютраствор 70 мг субстрата липазы сложного (6-метилрезоруфинового) эфира1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-З-тетрадекановой дикислоты, растворенного в1,7 мл п-пропанола.При этом получены следующие тестспецифические параметры (ср. пример23 и табл.1): величина холостого опыта 0,2 мЕ/мин; активность эстеразы0,7 мЕ/мин; чувствительность липазы23,6 мЕ/мин на 100 ед/л; коэффициенткорреляции 0,09509П р и м е р 29. Сложный (6-метилрезоруфиновый) эфир 1,2-0-дилаурилрац-глицеро-глутаровой кислоты.а). Получение аналогично примерам76;с 2,3 г (10 ммоль). 4-метилрезоруфина.ДС: К, = 0,68 (уксусный эфир -гексан 1:2),Ь). В 60 мл дистиллированной воды растворяют при перемешивании 0,9 гтауродезоксихолата натрия и 0,3 гколипазы (от свиньи). При хорошем пе"ремешивании впрыскивают туда растворсложного (6-метилрезоруфинового) эфира 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-глутаровой кислоты, 70 мг в 1,7 мл ипропанола. Затем добавляют раствор(200 мл), который содержит в 200 мл0,5 г мочевины, 1 г тауродезоксихолата натрия, 200 мл хлористого натрия и 2,9 г ТК 18 и устанавливаютего величину рН до 7,5. После хорошего перемешивания 2,5 мл полученноготаким путем раствора смешивают с100 мл пробы (сыворотка). Реакцию наблюдают при 578 нм рт.ст. по фото