Способ получения баумицина а и в

О е Й баумицин ли баумицин В) Составитель С.Малю едактор В.Данко Техред М,Голинкаина Корректор М.Кос каэ Подписноекомитета СССРоткрытийкая наб., д.4/5 иал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4 300 мл н-гексана, центрифугируют в течение 5 мин со скоростью 300 об. /мин для удаления примесных веществ, растворимых в н-гексане. Полученный осадок (1,2 г) растворяют в 100 мл .хлороформа и трижды экстрагируют 150 мл 0,01 М уксусной кислоты до получения растворимых в кислоте веществ, К этому экстракту добавляют 2 М раствор трио-оксиаминометана для установления рН 8,5, а затем полученный раствор трижды экстрагируют 100 мл хлорофор" ма. Таким образом, получают 97 мг неочищенного порошка красного цвета (комплекс баумицина) из слоя хлороформа путем концентрирования досуха при пониженном давлении. 15Полученный таким образом неочищенный продукт (97 мг) растворяют в 2 мл смеси хлороформ . - метанол (10:1 вводят в колонку длиной 65 см и диаметром 8 см, заполненную 60 г крем невой кислоты, и промывают смесью хлороформ - метанол (10:1).В начале элюируют Фракцию А, затем последо" вательно фракции баумицина А, В и В при этом используют в качестве элюента смеси хлороформ - метанол (8:1, 5:1 и 2;1).После того, как каждую иэ активных фракций собирают отдельно и кон" центрируют досуха при пониженном давлении, их вводят в колонки 25 см длиной, 1,8 см диаметром, заполнен" ные Сефадексом (,Н, и промывают смесью толуол - метанол 3:1. После концентрирования каждой из фракций, полученных ранее, после добавления к концентратам н-гексана получают красные порошки: 10 мг баумицина А, 5 мг баумицина А , 1 мг баумицина В и 3 мг баумицйна В.Предлагаемый способ позволяет по лучить антрациклиновые гликозидные антибиотики баумицина А и В. 8121/85 Тираж 531 ВНИИПИ Государственног по делам изобретений 113035, Москва,Ж, РаушСпособ получения баумицина А и Вобщей Формулы о т л и ч а ю щ и й с я . тем, чтоштамм 5 г.герсоаусее соегц)еогцЬдцьМЕ 130-А 4 (АТСС 31276),5 сгерйоаусеврецсей 3 сцэ яцЬвр.сагпец АТСС 21354,5 Сгерйощусев рецсессрь ьцЬьр.саеьйцвМай-Вили 5 йгереощусеэ рецсе"й)сць ййй-Вкультивируют ваэробных условиях на питательной сре -,де, содержащей источники углерода,азота и минеральные соли .с последующим выделением целевого продукта,прйнеобходимости антибиотик хроматографически разделяют на компоненты А иВ и переводят в соли.Штамм обладает следующими культу-рально"морфологическими признаками.Под микроскопом наблюдаются открытые спирали и крючкообразные формы,которые значительно развиты из разветвленного субстрата мицелия. Кольца отсутствуют, цепь споры имеет умереннуюдлину с числом, спор больше 10.Размер спор 0,6-0,8 мкм Х 1,01,2 мкм, поверхность спор покрыташипами,Глицериново-аспарагиновый агар. 10Нити от бледно-красновато-желтого дотемно-красного, Воздушный мицелий во-.дянисто-серого цвета. Растворимый пигмент " светло-красновато-желтый.Сахарозо-нитратный агар. Сусбратныймицелий - нити бледно-красновато-желтые, бледно-красные до темно-красных.Воздушный мицелий слегка белый. Растворимый пигмент - слегка темнокрасный.20.Глюкозо-аспарагиновый агар, Нитибесцветные, бледно-желтые до бледнооранжевых. Воздушный мицелий от слегка белых до светло-серых, становящихся обильными через 14 дн инкубирова- .25ния.Растворимый пигмент отсутствует.Тирозиновый агар. Нити серовато- красно-коричневые. Воздушный мицелий от сине-белого до светло-синего. Темно-коричневый растворимый пигмент.ЗОПитательный агар, Нити желтовато- коричневые. Воздушный мицелий белый. Растворимый пигмент коричневый.Агар с дрожжевым экстрактом н солодовый агар - нити тускло-оранжевые. Воздушный мицелий светло-серый. Растворимый пигмент слабо-коричневый,Агар с овсяной мукой. Нити от бесцветных до бледно-оранжевых. Воздушный мицелий светло-серый. Раствори мый пигмент отсутствует.Глицерино-нитратный агар. Нити от бесцветных до бледно-оранжевых. Воздушный мицелий от белого до светлосерого. Растворимый пигмент отсутст . вует.Снятое молоко -нити бледно-желтовато-коричневые, желтовато-коричневые до бледно-красных, воздушный мицелий слегка белый. Растворимый пигмент коричневый.физиологические свойства штамма.Оптимальная температура роста от 30 до 37 С. Желатину разжижает. Крахмал гидролизует. Молоко пептонизирует и коагулирует при 37 С. Меланин образует. ХорОшо растет с глюкозой, А"арабинозой, О-ксилозой, сахарозой, раттинозой, О-фруктозой,с-рамнозой, маннитом. Разжижает яблочнокислыйкальций. 60Получают баумицин путем культиви-,. рования штамма в стандартной водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота н неорганических солей. В качестве источников углеро да используют глицерин, глюкозу, крахмал, декстрин, сахарозу, мальто-, зу, масла, жиры. В качестве источников азота используют соевые бобы, дрожжевой экстракт, пептон, порошок семян хлопка, сухие дрожжи, жидкость для замачивания зерна или неорганические соли, такие как сульфат ам" мония, нитрат натрия или хлористый аммоний, из неорганических солей используют хлористый натрий, хлористый калий или фосфаты, при необходимости добавляют следы металлов и пеногасящие вещества, такие как адеканол или силиконПредпочтительной температурой культивирования является 25-30"С.Максимальный выход баумицина в бульоне культуры достигается через 3-7 дн.Для извлечения баумицинового комплекса бульон подвергают фильтрованию и фильтрат затем подвергают экстрагированию несмешивающимся с водой органическим растворителем, таким как этилацетат, бутилацетат, хлороформ или н-бутиловый спирт. Баумицин,находящийся в мицелии, извлекают хлороформом, ацетоном, н-бутанолом, метанолом, этанолом, этилацетатом иливодным раствором органической или неорганической кислоты, такой как соляная кислота, серная кислота или уксусная кислота.После концентрирования в вакуумебаумициновые экстракты повторно экстрагнруют органическим растворителем,несмешивающимся с водой при рН 7-9, И затем баумицин растворяют в кислой водной среде при рН ( 4.Затем баумицин в кислом водном растворе подвергают повторной экстракции органическим растворителем после регулировки рН до слабо щелочного значения.Баумидин может быть извлечен из культуральной жидкости хроматографией на колонке с применением таких. адсорбентов как активированный уголь,алюмогель, кремневая кислота или модифицированный декстран марки Сефадекс Н, противоточным распределением или жидкостной хроматографией с применением органических растворителей.Полученные таким способом активные экстракты концентрируют при пониженном давлении и в результате получают сырой красный порошок баумицинового комплекса.Для получения баумициновых компонентов А,А ,В,и В 1 осуществляют дополнительную очистку и разделение наколонке с использованием таких адсорбентов как кремниевая кислота, модифицированные декстраны, слабо кислыеионообменные смолы или активированный уголь, а также жидкостной хроматографии с противоточным .распределением и867318 Баумицин Ай Слабощелочной аморфный красный порошок Внешний вид Н й Элементарныйанализ О. О 2,04 29,83 60,27 6,72 231 29,52 2,08 30,88 60,61 6,43 2,08 30,88 Найдено 59,85 6,65 Теоретическое 60,61 6,43 ЭмпирическаяФормула 34 43 Я Молекулярныйвес 673,7 Точка плавления,о С 185"189 182-185 Удельное вращениееЦ3+150 Растворим в кислой воде, диметилсульфоксиде, метилцеллозолве, метиловом спирте, этиловом спирте, н-пропаноле, н-бутаноле, этилацетате, бутилацетате, ацетоне, метилэтилкетоне,хлористом метилене и хлороформе. Нерастворим в воде, н-гексане, циклогексане и петролейном эфире. Растворимость значенияС:Мщ 10:1 0,25 0,08 С:М:В=7:ЗйЗ 0,39 028 0,26 СфМ:Г=90 ф 10:1 0;17 0,64 0,74 С:М А=8020:4 Кислый водный и метанольный раствор является красным, и переходит в красновато-пурпурный в щелочном состоянии. Баумицйны А и А дают положительную нингидриновую реакцию, и невосстайавливают раствор фехлинга. Реакция с применением приемлемых органических растворителей.Активные элюаты разделяют, концентрируют при пониженном давлении и баумициновые компоненты индивидуально, очищают хроматографированием на Сефадексе АН. После концентрирования активных элюатов путем перекристалли зации из приемлемого органического растворителя получают баумициновые компоненты А,А , В и В в очищенной кристаллической форме.2 5физико-химические свойства баумицина А 1,А, В и В представлены втабл.1.Таблица867318 Продолжение табл.1 1 Баумицин Уф- и видимый спектрпоглощения и максимальный (Е ф)в МеОН в 0,1 й НС 1 - МеОН 250,5(421); 350(80);558(170); 596(164) 250,5(416); 350(83);558(164); 597(152) в 0,1 й НаОН-МеОН Баумицин Слабощелочной аморфный красный порошок Внешний вид Элементарныйанализ О Н 57,32 6,45 2,02 32,58 56,59 5,96 1,92 31,91 6,01 2,04, 32,57 5938 6,01 2,04 32,57 5938 Эмпирическаяформула Молекулярнййвес687,7 Точка плавления, С 181-189 197-201 Удельное вращение Ь.2 оЪ+170 +170 (СНС 1 г МеОН 1 з 1;С 0,1) Растворим в кислой воде, метилцеллоэолве, метаноле, этаноле,н-пропаноле, н-бутаноле. Нерастворим в воде, этилацетате,ацетоне, хлористом метилене, хлороформе, четыреххлористомуглероде, бенэоле, толуоле, этиловом простом эфире и н-гек-.сане, кроме того баумицин В растворим в воде Растворимость НайденоВычислено 234,5(452 252,5(327),289(120 478(127)у497(128) 1 532(76) 234,5(459), 252,5(326);289(121)р 479(133);497(133) 1 532(78) 234,5(427); 252,5(311);289(108) р 478(125);497(128)р 532(84) 234,5(447); 252,5(311);289(111); 478(131);497(131); 532(70)867318 Продолжение табл.1 Баумицин и эиаченияС:М=10:1 0,07 0,01 СфМфВ=7 зЗ3 0,39 0,14 СзМзВ=90 з 1011 0,18 0,10 СвМфА=80 з 20 в 4 0,64 0,30 Кислый водный и метанольный раствор является красным, а вщелочной среде становится красновато-пурпурным. Баумицин В 1и В 1 дает положительную нингидриновую реакцию, и не восстанавливает раствор Фехлинга. Реакция Баумицин 234(575) 252(414);290(130) 478(176) 1 495(183) 530(120) 234,5(552); 253(385)р290(132 р 476(179);495(181); 530(101) 234(580); 253(397)1 290(140); 479(182);495(184) 530(100) 234(616)253(419);290(145)3 476(195)3 494(191)1 529(105) в 0,1 й НС 1-МеОН 251(499)У 350(74)1556(231); 594(218); в 0,1 М йаОН-МеОН 251(453); 350(65);556(206); 594(195) Баумицины Аи А, В и В являются стереоизомерамй отйосительно друг друга и могут легко различатьсяпо физическим свойствам - различныточки плавления, удельное вращение, - коэффициент йу для тонкослойной хроматографии, ЯМР-,пики. Минимальные подавляющие концентрации,мкг/млИспытуемый организм баумицин баумицин баумицин баумицин А Аа 5 йарЬ,аогеозГО А 209 Р 3,12 100 50 1,56 5 йарЬ.ацгець 5 аЬ 0,78 50 50 1,56 Уф- и видимый спектрпоглощения и максимальный (Ефф)в МеОН 45 Баумицины А,А , Г и В облада 1ют противомикробной активностью против широкого спектра микроорганизмов. 50 Противомикробный спектр баумнцинов А,А,Ви В указаны в табл.2.1Таблица 212 867318 Продолжение табл.2 Испытуемый организм Минимальные подавляющие концентрации мкг/мл е баумицин баумицин баумицин баумиА 2. В 1 цин В 2 3,12 100 100 100 100 3,12 В.ведайег 1 ааМВВ 1. В1,56 100 100 6,25 5 агс 1 па 1 цйеаАТСС 9341ИсгососсО 5У 1 ачз/деньФ 1 5 5 4 6 ано 117 2 9 О 710 5 173 163 0 0,1250,06 151 1413.00 187 155 0 0,01 0,00 31 0 004 В.вцЬй 111 а АТСС 6633 0,78 В.сегецз АТСС 9634 1,56 Рь,Г 1 оогевсепь М 1 Н В 100 Ргойецв аогдап 11 )100 Как следует из табл.2 баумицины А,А,Ви В 1 Обладают противомикробной актйвностью, особенно против грам-положительных бактерий, и следовательно являются,терапевтически пригодными для лечения животных и человека от дифтерии, туберкулеза, пневмонии, тетануса и других инфекционных заболеваний, вызванных грам-положительными бактериями.45 Баумицины А,А,В и В 1 обладают ротивоопухолевой активностью при низкой токсичности, что было уст влено в экспериментах на подопытных животных, и таким образом являются терапевтически полезными для подавления роста опухолей у млекопитакщих, В частности, баумицины А,А,В и В оказывают значительное подавляющее действие на а,-1210 лейкемию у мышей. Например, мышейа заражают интраперитониально 1 и 10 -1210 клетками иэ расчета на одну мышь, и спустя 24 ч после заражения интралеритониально вводят лекарство один раэ в день в б течение 10 дн, На 30 дн. определяют процент продления времени выживания по сравнению с контрольными животными. Результаты экспериментов пред- ставлены в табл.3. б Продление времени выживания,В15-20 баумюцин А баумицин В 40-б 0баумицин В 1 75"100Соединения по .предлагаемому изобретению образуют нетоксичные соли -аддукты кислот с различными органическими и неорганическими солеобразующими реагентами, а также нетоксичные комплексы с деокснрибонуклеиновой кислотой. Так, соли-аддукты кислот, полученные с такими Фармацевтически приемлемыми кислотами, как серная, фосфорная, соляная, уксусная,пропионовая, и кислоты оленновая,пальмитиновая, лимонная, янтарная,винная, глутаминовая, пантотеноваяи т.д., нетоксичные комплексы с деоксирибонуклеиновой кислотой могутприменяться так же, как и сами баумициновые соединения. Соли получают, 25выделяют, очищают и формулируют способами, обычно применяемыми при приготовлении.солей для антибиотикбв.формы для внутрибрюшного введения включают стерильные вЬдные или 10неводные растворы, суспенэии илиэмульсии. Они также могут производиться в виде стерильных твердых составов., которые могут растворяться встерильной воде, физиологическом растворе или некоторых других стерильных пригодных для вспрыскивания средах непосредственно перед применением.,Применяемые предпочтительные количества баумицинового антибиотика .40необходимо менять в зависимости отприменяемого соединения; от типа композиции, схемы лечения и типазаболевания. Обычно баумициновые антибиотики впрыскивают животным внутрнбрюшно, внутривенно,подкожно или местно,а человеку внутрибрюшно или местно.Следует учитывать многие факторы,которые модифицируют действие лекарства, например возраст, вес тела, рпол, диету, Время введения, схемулечения, скорость введения, состояние пациента, комбинацию лекарств,чувствительность и тяжесть заболевания. Введение может осуществлятьсянепрерывно или периодически с применением толеравтных доэ, Оптимальныеприменяемые количества для данногоперечня условий могут быть установлены специалистами в данной области сприменением стандартных методов испытаний.При применении баумициновых композиций в качестве противомикробноговещества композиции обычно вводяттак, чтобы концентрация активного 65 1,5 0,1 0,1 0,3 0,125 (рй 7,.4) 2,50,250,320,125(рН 7,4) МинералфСц 504 ЬНО 1,25 г М и 5 044 Н 10 1,25 г 2 п 504. 7 Н О 12,5 гв 500 мл воды.Приготовленный бульон культуры Фильтруют для отделения фильтрата культуры и мицелия. Фильтрат трижды экстрагируют 1/5 объема хлороформа. Мицелий трижды зкстрагируют 2 л ацетона на 1 кг Фильтровой лепешки, и полученный ацетоновый экстракт концентрируют до половины объема при пониженном давлении.Концентрат трижды экстрагируют 2 л хлороформа, объединяют слоро- формовым раствором, который получают из фильтрата культуры, и концентрируют досуха при пониженном давлении.10 г маслянистого вещества растворя" ют в 50 мл хлороформа, и образующийся при добавлении 300 мл н-гексана осадок центрифугнруют в течение 5 мин при 3000 об./мин для удаления неочищенных веществ, растворимых в . Острая токсичность. Величины Ы О т при внутрибрюшном введении антибиотиков следущие:50 (мг/кг)баумицнн А 1,5"2,5 компонента была выл е минимальной подавляющей концентрации для конкрет" ного типа организма, который лечат.П р и м е р 1. Готовят питательную среду следующего состава, вес;Ъ:Картофельныйкрахмал 1Глюкоза 1Порошок соевыхбобовкнро 4М 95047 Н 10НаС 1Минерал- Сц 504 5 НО 2,8 гРе 504, 7 Н,О 0,4 гМпС 11 4 Н, 03,2 г2 п 50 7 НО 0,8 г в 500 мп воды,50 мл этой среды стерилиэуют при 120 оС в течение 15 мии в 500 мл колбе, которую засевают косой культурой агара 5 сгеровусеь соегц 1 еогцЫ дць МЕ 130-А 4 с помощью платиновой петли.Инкубированне производят в течение 72 ч при 28 оС навращаевейся мешалке (230 об/мин) . Среду используют в качестве посевного материала. Готовят 7 л следующей среды, и 50 мл порции среды, введенные и стерилизованные в 500 мл колбе, асептически засевают 1 мл указанной культуры. Брожение про водят при 28 оС в течение 7 дн на вращающейся мешалке (230 об./мин), Получают, вес.Ъ:Сахароза 4Порошок соевыхбобовНаЮКарбонат кальцияМинерал(рН 7,4)тот же, что и в примере 1.Готовят 8 литров укаэанной среды, которую распределяют по 50 мл порциями по 500 мл колбам, стерилизуют при 120 С в течение 15 мин и засевают 1 мл посевного материала 1 гереоаусев.55 рецсейсцв вцЬвр.сагпецв АТСС 21354, приготовленного в соответствии с методикой примера 1. Брожение осуществляют на вращающейся мешалке при 28 Со в течение 6 дн. Бульон культуры филь- щ 0 труют для отделения мйцелия от Филь- трата культуры. Осуществляют экстрагирование хлороформом и ацетоном,как и в примере 1, и получают 10 г маслянистого продукта. Последний раство н-гексане. Полученный осадок (1,4 г) растворяют в 100 мл хлороформа и трижды экстрагируют 150 мл 0,01 М уксусной кислоты для получения веществ, растворимых в кислоте. К экстракту добавляют 2 М трис-оксиамино-метано- вый раствор, доводя рН до 8,5, и за 5 тем раствор трижды зкстрагируют 100 мл хлороформа. В результате получают 230 мг красного сырого порошка (баумициновый комплекс) из хлорофор" мового слоя путем концентрации досуха при пониженном давлении.П р и м е р 2. Сырой порошок, по" лученный в примере 1 (230 мг), растворяют в 2 мл смеси хлороформа и метилового спирта (10:1), вводят в колон" 15 ку длиной 65 см и диаметром 8 см, заполненную 80 г кремневой кислоты, и промывают смесью хлороформа и метилового спирта (10:1). Сначала элюируют баумициновую А,-фракцию, а затем по следовательно баумицины А ,В и В, применяя соответственно в качестве элюирующего раствора смеси 8:1, 5:1 и 2:1 хлороформа с метиловым спиртом.После того, как каждую активную фракцию собирают отдельно и концентрируют досуха при пониженном давлении, кажцую такую Фракцию вводят в колонку длиной 25 см и диаметром 1,8 см, заполненную Сефадекс АН, и промывают смесью 3:1 толуола и метилового спиртаПосле концентрирования каждой полученной фракции путем добавления к концентрату н-гексана получают в виде красных порошков 10 мг баумицина А, 18 мг баумицина А 1, 3 мг баумицнна Ви 1 мг баумицина В.П р и м е р 3. Готовят питательную среду следующего состава, вес,Ъ:Картофельный крахмал 2 40Глюкоз а 2ДрожжевойэкстрактХлористыйнатрий,2545Карбонат(рН 7,4)2,8 г0,4 г,3,2 г0,8 г а -Сц 0 5 Н 10Ге 04 7 НОНпС( 4 Н 202 П 04 7 Н 2.0в 500 мл воды. 50 мл этой среды стерилизуют при 120 фС в течение 15 мин в 500 мл колбе, которую инокулируют платиновой петлей культуры 1 героеусев рецсеФ 1- сцв вцЬвр.саевсцв МВВ-В, выра" щенной на скошенном агаре.Инкубирование продолжают в течение 72 ч при 28 С на роторном шейкере (230 об./мин). ряют в 100 мл метилового спирта и растворимых в н-гексане веществ путем добавления 100 мл н-гексана и получают 1,2 г осадка после удаления.Красный осадок растворяют в 100 мл хлороформа и экстрагируют 600 мл буфера-ацетат натрия (рН 3,0) для получения растворимой в воде субстанции.После, добавления к экстракту 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты в количестве, необходимом для получения раствора 0,01 М, регулируют рН до величины, равной 8, для чего добавляют 4 М хлоргидрата натрия.Активные компоненты этого водного раствора экстрагируют четыре раза 200 мл хлороформа, и затем дважды экстрагируют 500 мл н-бутилового спирта. Получаемые хлороформовый и н-бутанольный слои концентрируют порознь при пониженном давлении и получают 200 мг красного порошка, который в основном представляет собой баумицин В, Этот сырой порошок растворяют в 5 мл хлороформа - метилового спирта, вводят в колонку длиной 23 см и диаметром 3,0 см, заполненную 80 г кремневой кислоты, и промывают смесью 20: 1 хлороформа и метилового спирта. Баумицин Ви В 1 элюируют последовательно смесями 5: 1 и 2: 1 хлороформа и метилового спирта. Фракции баумицинов В и В концентрируют порознь при пониженном давлении, в результате чего получают 50 мг баумицина Ви 8 мг баумицина В.Полученные баумициныВ и В 2 перекристаллизовывают из метилового спирта и получают 31 мг и 6,5 мг кристаллического материала соответственно. При указанном спосо" бе получают очень незначительные количества баумицина Аи А.П р и м е р 4. Готовят питательную среду следующего состава, вес,%:и 1,8 см в диаметрь, заполненнуюСефадексом Ни промывают смесьютолуол - метанол (3:1), После концентрирования каждой иЗ фракций, полученного при добавлении н-гексанак концентратам, получают красные по"рошки: 11 мг баумицина А, 10 мгбаумицина А, 7 мг баумицина В, и .3 мг баумицина В.П р и м е р 5. Получают питательную среду следующей композиции, вес.%КартофельныйкрахмалГлюкозаСоевый порошокКНР 0415 н 950+7 НОйаСМинерал Готовят 7 л описанной средй и .50 мл среды, находящейся в стерилизованной 500 мл колбе, асептически инокулируют 1 мп указанной посевной культуры. В течение 7 дн на роторном шейкере (230 об./мин) проводят ферментацию при 28 аС, вес.В:(рН 7,4)1,25 г1,25 г12,5 г 1 1 1,5 0,1 0,3 0,125 (рН 7,4) 2,8 г 0,4 г 3,2 г 0,8 г- Сц 50 5 НО Мпс 11 4 Н 4,0 Еп 504, 7 Н 10 в 500 мл воды. Полученный культуральный бульон от ильт овывают ля того чтобы аз гируют 2 л.ацетона на 1 кг лепешки,иполученный ацетоновый экстракт концентрируют до половинного объема припониженном давлении. с хлороформовым раствором,.которыйполучают для фильтрата культуры, иконцентрируют досуха при пониженномдавлении, 10 г полученного маслянистого вещества растворяют в 50 мл хлороформа, а осадок, выпавший при добавлении 300 мл н-гексана, центрифугируют в течение 5. мин при 3000 об. /миндля удаления примесных веществ, расдок (1,8 г) растворяют в 100 мл хлороформа и экстрагируют трижды 200 мп0,01 М уксусной кислоты до получения 40растворимого в кислоте вещества. Кэтому экстракту добавляют 2 М растворатрис-окси-аминометана для установле 0,320,125(рН 7,4)1,25 г1,25 г12,5 г ния рН 8,5; а затем этот раствор триж-Сц 50 5 НОНпС 14 НО2 п 504 7 Н 0в 500 мл воды.Полученный таким образом культуральный бульои отфильтровывают для разделения фильтрата культуры и мицелия. Фильтрат трижды экстрагируют 1/5 объема хлороформа. Мицелий экстрагируют трижды 2 л ацетона на 1 кг лепешки, и полученный ацетоновый экстракт концентрируют до половинного объема при пониженном давлении,ды экстрагируют 100 мл хлороформа. В 45 результате получают 185 г красного неочищенного порошка (комплекс баумицина) из слоя хлороформа после коицентрирования его досуха при пониженном ,давлении. 50185 г полученного неочищенного порошка растворяют в 2 мл смеси 1 слороформ - метанол (10:1), вводят в колонку 65 см длины и 8 см в диаметре, заполненную 80 г кремневой кислоты, и промывают смесью хлороформ - метанол (10:1). Вначале элюируют фракцию баумицина А, затем последовательно баумицин А 1, В и Ь 2,причем, соответственно, в качестве элюента используют смесь хлороформ - метанол (8:1, 605:1 и 2:1).Каждую активную фракцию собирают отдельно и концентрируют досуха при пониженном давлении, каждую иэ этих Фракций вносят в колонку 25 см длиной 65 Концентрат трижды экстрагируют 2 л хлороформа, объединяют с раствором хлороформа, который получают иэ фильтрата культуры, и концентрируют досуха при пониженном давлении. 10 г полученного маслянистого вещества растворяют в 50 мл хлороформа и осадок, образовавшийся при добавлении ф д/ Рделить фильтрат культуры и мицелий. -Сц 5045 НО Фильтрат трижды экстрагируют 1/5 объ Ге 504. 7 Н 0 ема хлороформа. Мицелий трижды экстра- НпС 11 4 Н 02 п 5047 Н 40в 500 мл воды50 мп этой среды стерилиэуют при120 С в течение 15 мин в 500 мл колбе, которую,инокулнруют платиновойПолученный концентрат трижды экс- петлей культуры 5 йгерйоаусез рецсес 1" трагируют 2 л хлороформа, объединяют сцз ййн-В"3826 на скошенном агаре.Инкубирование проводят в течение72 ч при 28 фС на роторном шейкере(230 об./мин). Готовят 7 л описаннойдалее среды и 50 мп среды, распределенной и стерилизованной в 500 млколбе, асептически инокулируют 1 мпукаэанной культуры. Ферментацию про"водят при 28 С в течение 7 дн на роторном шейкере (230 об./мин) . Полу творимых в н-гексане. Полученный оса- чают, вес.з:СахарозаСоевый белок 2,5йаС 1 0,25