Способ получения антибиотика тиенамицина

ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ Созоз Советезсмх Соцмалмстззчезсзвх РеспГблнн(32) 25.11.7 (33) СЫА его аеударствееьзР ааматет6 аеата Мазеатраа СССРаа делам азабретееВа аткрззтей ковано 15,10,7, Бзоллете УДК 615,779.93(45) Дата опубликования описания 1.11,7 2) Авторы иаобрете вцы), Фредерик Мзрвнн Ка хан (КанадаЧомас Гозгезпман Дз 1 А)вандее (Бланка)фирмааед Ко., Ивк.") Совайер Кахан (СМд Олли Степзнз, зооерти Себастьян ЭрНюстра инаяМерк(7) Заявитель Изобретезпте отззоснтсн к Обззасзн микробззззезе" знн. к полумнию антнбнотнка, который являетоз вьздцмо ффезхтнвныьз прнщфщованев рос та раз ззи%ьзх Граааполоэнтелызьгх н грсзмотризЗатезтьзп ьзнкроофзтзнизюазв.предложенный способ полученвл антнбиотзнса тненаьпззнзна новый, в патентной н ззаучно-техническойй литературе зФ Опизззьбретвжя; ЯВлнется получеззне антнЦелью изобиотнка тненазазЭта цизьзззусез саТ 1 еуаЗзервзззЗей исто"соли, с послеВРИ продуктаАнтибиотик 8 тгерто.уют в аэрабной среде; со.и мнюральвьзеочисткой целе. Зазсзнгается темр что ззззвмм И 118 1. 8057 культнвнр иззньзх услОВиях В пззтвтель пнпсн угззеродй азота дуаацим выделением нтиенамн оор гани зма ыделен из в коллекполучают Путем вьзращиваиня мнкр Бтгертозтзусеа саЮеуа. Этот штамм В образца почвы и обозначен как МА - 4297 цин культур Мерк енд К, Инк, райней,2%жтззекзьйз куль:". Северзпззх регноззальньж ззабо"раторнй по псстждовазлзям, Северьаго атдсленнз понсззользоваззнр носззедоддззнф н откоьзтв-з слу оысезтьсзсохозяйственньзх ззосззедовекЖ отдеззанвлоальского холзйства С 1 А, Ъорззя, Иллинойс и ейприсвоен номер МВВ 1. 8057,Культуразн но морфологнческю прнзааки пзтам.ма Ятгертоозусез саТТЗеуа РЗЯЯ 8057.Морфолощл, Спорофоры Являзет Я плотнымисннралямн, встречзвшжмнсн В Виде бокавьж нкощчных ветвей на воздупзном мзпзеззжн. СЫОРыззпзнззссндаглые до цнлнндрнчесзснх, 0,9 х 1,2 мкм,с цепнъаз до 10 ьпсм и более,Кузпауразтьзыз признаки,Ахар из томатной пасты н сзвсяззой муки. Везтзтаттзвньзй рост переменньзйу зьззхевато.коричзВВьзй,плоский, пространственный, воздуппзьй мицелнйорхидея с белым, расзвотезмого пигмента нетАпзр Чапека. Вегетатнвньзй рост бесцветззьзй,плоский, пространственный, Воздупнзый мнцелийредкий, розовато.бельй, растворимого пигментанет.Агар яичного альбумина. Вегетатнвный рострыжвапз.коричневый со следами серо- орхидейизз.го, плоский, пространственный, Воздушный мицглий - орхидея со светлыми тенями орхидеи и белого, растворимого пигмента нет.Агар глицероля аспаргина. Вегетативиый рост переменио рыжевато-коричневый со следами серо- розового, плоский, пространственный, Воздушный мицелий . орхидея с белым, Растворимого пигмента Агар пелтон-железодрожжевого Экстракта. Ве.гетативный рост рыжевато коачнгвый, воздушного ьв 1 целия нет, растворимый пигмент слегка ко.ричневатый, меланин не усваивает, На 3 не Образует.Питательный агар. Вегетативньй рост светлыйрыжевато-коричневый, воздушного мицелия нет,растворимого пигмента нет, йАгар питательного крахмала. Вегетативньй росткреовый до рыжевато-коричневого Воздуциогомицелия нет, растворимый пигмент Отсутствует,Крахмал гидролизует умереюо,ДтатЕЛЬдГЗ жг 1 ТИНОВЫй а-",1 О Ягэ, р.грущу":РОСТ КСЕКОВЫй ВОЗДЧТОТО Мнцгпнл Лгт. ,ЬЗЛ гн 1 Гразжиаг тщ 1 д 1 О; НЮ 1 ЬТ, ЗУ .,З"РЗЗУ ".: 111 ОЗУ ЫЗИЦТ."Э , ",ЮР " га гЖжг КРОХИ".ПЬ 1, Нг 1 гРН 1 игр Зеро Огса 11 З:",й;,г г .,11 У" 1. О 1" .,Зуют ОтдгГЬиО И 1 ГИ В СОЧгтсзр 51 В КВЯ дг гстуд;г.ад .,ЦУЦС гЕМГ,Г 1",11 гог1 "П 1 1 ЕПгЩгЩг. Й:ИЪ 1 ЧЕСТЗО УГ 1 тг ВОД 3 СОСТЙВЗЫЕТ УЕО.я 1 гР 1 О . - ".3;оОТ ЭЮСВ яйся," - -1 "-КД 1 ТВ,стогПКЗ аЗОТЗ г 1 У.Г О,",г 1 д"Ь1 З 1,:ЦРО 1 П"ЯДТЬ 1 КаЗЕГ 1 И 1 ГХ 1 СТВОР 11 РДг гг:1 С 1 гвг 1 Л 1 -:- ЗТОМаТВВЩ 1 П 1 СТ;"-3"ГЕДДИ азо И, .ОЛЬЗ:,-.ОТ ; 1-Г=УВчествг 0,2 - с% От веса ВОдной сгЩ 3Йрямгняют питзтельиыг неорганичг: пе СОп 1 ко.торь 1 е дают натрии калии аммоиии кальции фосгратсульфат, хлорид, карбонат, можно также вклюа 1 тьс 1 идм мбилЯОВ, например кобальта маги 1 я ителми марганца, Ь 5Ферментацню проводят при 2 Одля полу.чения оптимальных результатов - при 22 - ЗО С, рИа 1 тввльиой среды 6,О - 8,0,Фавментацию осутцествляют в глубинных услоЮ Незначительную ферментацию антибиотика проводят путем инокуляции питательноЙ среды анти. биотиком продуцентом и после переноса в средупродуцент ферментацию проводят при постоянной температуре около 24 С в теченче нескольких дней.Сосуд с посевом встряхивают при постоянной комнатной теьп 1 е 1 ратуре 1,28 С) в тече 1 иг двух дней или до получения удовлетворительного роста и некоторые из полущ:нных вновь культур ислользуют для ннокулнции, второй стадии посева нпи среды. нродуцента,Для палучг 1 в 1 я ьэльимх количеств а 1 гтибнотпа фермгнта 1 В 1 ю проводят в баках, сяабжг:агь 1 х смгси. ТЕЛЕМ И СРЕДС ВЗМ 1 ДДЯ аЗРРОДЗР.1 г ИОЙ СРЕДЫ. ЙИтатгЛЬИУЮ СРЕДУ ЦОЛУг 1 ЗЮТ В баСЕ И СтгРИЛИЗУЮТ НЗГРгиаи 11 гМ ЛРН Тг 11 г г . - Р:г ОКО, ло "2 ОС. Ир 11 охлаждг 1 г и гте",.:.1.":1 ззва 1 а," г "раду ПрганнаЮт ПргдВарнтгЛЬ 1;О ПрораЛКГ ЛСсвагКупатЫ, ПгО 1 цг 1 Г 1 З Затгы гр 1 Р;г, г;-,",ЮПЛ Г Ггг 1. г,""., =г Г;".- ол; .- "-р года х :гО:.5 рг: л%ь",1111 г 48 час,и 1 г х ба ер и гъ,г ,щ,. , 1",;Омг п 11 п 1 не,ЕГО Ь З гзо ИСПОЛН ОВ ТЬ Ва.СВЕ ЗГТ п ЗтгрнннОТО црфиараЩ дЛЛ ДЧг 1 ЩЯЧ 1 ЬЕ 1 ДЯИ и ргзу 1 Дгатг заравзтяя Граьизноятельныи и грамотрьцательныьи бактериями например против ЯтаРу.1 ососсцз авецз, Рготецз а 1 гаЫ 11 з, Езсг 1 гг 1 СЫа со 11,5Его можно использовать как дополнение к корму животным и как дезинфектант.Применять в водных композициях можно в концентрации 0,1 - 100 г антибиотика на 1 млн.ч. раствора для ингибирования роста вредных бакте. рий на медицинском и зубном оборудовании и в качестве бактерицида в промышленном масштабе, например, в водных красках для кнгибирования роста разрушительных бактерий.Антибиотик тиенамицин можно использовать в различных фармацевтических рецептах в качестве ингредиента или в сочетании с одним илк более антибиотиками или одним или более фармакологи чески активными ВешестваьцАнтибиотик используют в форме капсул или таблеток, порошков, жидких растворов, суспензнй .ли эликсиров. Его можно вводить орально, топи. чески, внутривенно, внутримышечно.Таблетки и капсулы для Орального введения могут Оыть В дозкрОВке для Одноразового прюбе не 1 п:.я и могут содержать, нап 1 имер, связующие а ЧТЬСОЧ КаЬЕДЬ ааТКН ССРл, ОГ Гаеа У,ччяТдтк рол ОНН 1 ч/2 плк 7 а чр тозу, -азр, ".анСОВьнкрахмал, фосфат лбы, СобТО Т К ТЧ . - , - , Яч РЬрчЮПуЕ;ЕТЕч. 3 Ь пример стеарат к 3 г:пл, тальк, полнэкле:"=ликочь, кремнезем, дезгнлграторы, например кар;-Офель. ный кзахт гал плн соответствуюппте смачтсВаюгцне агг;,1 нчнрнр лаурияягорнсудьО 1 ат, 1 аолетки можно покрывать кзвестым методом, Ьып.Бе СМЕ Н МОГут бь 1 та и флррЕ ВОДНЬИЛН Ь-а -1. - , ГХ суспенй, растзоров, эмульс, сиропов, .эппя. ров жш в Виде сухого продукта дьч растворения с ВОДОЙ %л Дру."ими жидОстлп. Такие хндкне смесн могутт содерхать словные добазки апрн, мер агенты получения суспензй, например сорбнтоловый сироп, метилцеллюлоэу, глюкозу,ахарный сироп), ягела ин, гндрокснэтилцетпполозу, карбокснметилцеллюлозу, стеарат алньппщн В геле юв гидрогдннзованнье тпцевые жиры, агент-эьтук га торы . лежлтмк, сорбитанмоноолеат или каме%, неводные носитеги, которые могут вклющть пищевые масла, щпрнмер миндальное масло, фракционированное кокосовое масло, масляные эфиры, пропиленглнколь или этиловый спирт, презерванты, например метил нлн пропил лгидроксибензоаты или сорбиновую кислоту,Суппозитории должны содержать достаточное кОФнестзо основ, например масло какао щи дру. гие глнцериды.Композиции для инъекций могут быть в одноразовых дозах в ампулах или в дозах для многоразового использования с дополнительными агентами-консервантами.Композиции могут быть в виде суспензнй, Оастворов, эмульсий в масле нли водных носителях.Композиции могут быть также в виде порошка или жидких спреев или ингалянтов, лепешек или , полосканий для горла.,ЗНОЗЛ:Гч-ОТ чЬЮЧЕ ч Б ;.: Ъ Зь Л .:;.ыов, .:, Ь ь 1;с.1 ЫнОВ, ПиГченнын -тчйт можно Очистить и Щзутиьл 1 М тодйЫ Оч"фЗ-О -Нть-Д : лч,О Т "ОРОВ)"ОО ЧнщСЕНЮ" 31 йк " ЧЛ чТ"и т 3 туК 9 П 4 ралТВОр а",бИОТ а Ь.ТОНМЕр 41 р-. - лваог, 1 ф О. д ц ч л -. Ог. буль лгп л О 1,"-: - э. через кодог. "Одръео-".п.ч "ю "3- точо,",еууте 7 л,"лц 1 оного тпа В асср то;,. ТОГШапчорбат ЗЗТЕМ ЗЛЮЕруЮТ ПОГчОДЯ"ДМ Здеаь ,О:". ВЗПРИМЕР е.ЕЬЪ ВОДЙЗМ Ю рпдиом, поаты собирают во фракции, ра.щерР.-П Зави- ОТ , да КЦьнК-Т ЗатМ О 12 г Т ку завериют последозательньгми нроцессами со следу."атреями хрома тографнческньи средаын: анконообмешп ю смолы ткпа полисткролтрнметиламмо пл каконообмгшые смолы типа полнстнролсульфоната, гелепроннцаекье смолы и попи. ер.ай абсорбиГпя. Бноактттвнос з злхтов изме ряют путем пробы с применением Ы.арЬу Осоаиа ацгецз АТСС 6538 Р В качестве Оргынзма пробы,И р н м е р 1. Тоубку с лиофилкзованной культурой Ятгертогочсея сэТТ 1 еа Открывают все тично н содержимое взвешивают в трубке, сопФржащей 0,7 мл стерильных солей Девиса следующей композиции (г) Цктрат натрияКгНР 04КН 2 РО 4(НН 4),З 04МЦБО 4 7 НТОДистиллированная вода 05 7,0 3,0 1,0 0,1 1000 мл 6Для закапывания в глаза илн ушн используютиндивидуальные капсулы.Дозировка введения зависит от состоянвя бальМого, веса и типа инфекции, частоты введения н 5способа введения, при этом парентеральное введение является предпочтительным для большинства инфекций, а оральный путь - для книечных инфекций.Орально нли щрентерально антибиотик вводят 10в количестве 2 - 600 мг/кг в день, предпочтительно 5 - 100 мг/кг в яь раздельнымн дозама, т.е, 3 - 4 раза в день. Можно применять одноразовые дозировки, например 25, 250, 500 нлн 1000 мг активного ингредиента с подходящюин физиологически приемлемыми носителями или эксцнпиенПолученный антибиотик имеет активность50 - 400 ед/мл.Опщ:нньл тненаьицин получают путем применкя 4)нльтрацни геля через гель полакрпламида с 20 "РаэЕООМ ПОР НСЧаУсЩМ МОЛКУЛ ВЕСОМ ОО, лееВОЗ.Порцию 0,2 мл этой суспензии нсг-,.:.ь:уют дляпрививки косяка культуры среды А (люс агар) следующей композиции (г) .Среда ААвтолкзат дрожжей 10,05Глюкоза 10,0Фосфатный буфер 2,0Мд 804 7 Н 20 0,05Дистиллированная вода 1000 мл (рН до 6,5 применением ЧаОН)СФосфатный буферный растворКН 2 Р 04 91,0йаНРО 4 95,0Дистиллированная вода 1000 млДля косяков добавляют агар 25,0 г/л, 5 Привитый косяк подвергают инкубации 8 днейпри 28 С и хранят при 4 С.Порцию спор к воздушного мицелия косякаиспользуют для прививки колбы Эрлекмейера ем.костью 250 мл, содержащей 50 мл средыА (без агара), Колбу с посевом встряхивают при 28 С на шейкере со скоростью 220 об/мин в течение 2 дней, в течение этого времени получают удовлетворительный рост.15 колб Эрлейнмейера по 250 мл, каждая содержит 40 мл среды В, прививают 1 мл на колбу культуры из колбы посева. Среда В ю 4 еет следующую композицию (г).Среда ВКукурузная ьука 20,0 зО Барда 10,0Соевая мука 150 Нитрат натрия 4,0 Сас 1, гн,о 0,5Мд 8047 Н 20 0,1СаС 2 6 Н 20 0,01Ре 804 7 Н 20 0,01 Полигликоль 2000 0,25 об% Дистиллированная Н 20 1000 мл (рН доводят до 6,5 40 применением ИаОН)15 колб с продуктом встряхивают при 28 С нашейкере со скоростью 220 об/мин в течение 3 дней с пробами, полученными в процессе ферментацисят.ного цикла, В пробах применяют бульон, подверг 45 нутьтй центрифутированию.Через 53 час бульоны из 13 колб сливают. Частьподвергают центрифуткровакию и опробированию, Оставшийся бульон фильтруют, иоводят до рН 7 и 500 мл сушат при температуре ниже 0 С с получе 50 вием 10,7 г твердого вещества. 1,5 г последнего соединяют с 25 мл смеси л-бутилового спирта к воды (1:99), рИ раствора составляет 7,0, Раствор юиосят на колонку 5 х 118 см бкояля Р=2 (200-400 мети), которую предварительно уравно ветпивавтт смесью л-бутклового спирта и воды. Гель проявляют тем же раствором со скоростью 10 ыл/мии н собирантт 650 мл головного погона с 75 фракциями, 20 мл каждая. Поток злюента на правляют записывающим дифференциал ьком 60 8т,елрактометром Мекке. Каждую фракцию опробир;т ка антнбактерийную акткзность Ткекамицинlобнаружен во фракциях 34 - 40 с максимумом вофракции 37. 10 мл фракции 37 сушат при темт;ера.туре ниже 0 С с получением 2,0 мл твердого ве.щества, Последнее соединяют с 5 мл воны дляпробы. Пластины с пробой подвергают кнкубацки втечение ночи при 28 С,случили следующие реэуль.ТЗ ТЪ 1 .Концентрация, мг/мл Раэмет зов;, . дм, к8 ТарЬуссссо;.а аыгеоьАТСС 538 Р80 3040 2520 2110 17П р к м е р 2. Открывают асепткчески трубку слиофклизованкой культурой 8 тгертотусеа саттеуаи содержимое взвешивают в 0,8 мл стернлькыхсолей Девиса композиции примера 1,Суспензию используют для инокуляцик четырехкосяков среды А (плюс агар) с композицией,. приведенной в примере 1.Привитые косяки подвергают кккубации в течеоние недели при 28 С и затем храня: ттрк 4 С.Порцию спор и воздушного мкцелкя одного кэкосяков используют для прививки в колбе Эрлен.мейера емкостью 250 мл: посевом, содержащей;:А Колб; л: аэч встряхиваютгпри 28 С со скоростью 220 об/мик в течение 2 дней,затем получают удовлетворительный рост.Ислгитьэууют 15 колб Эрленмейера емкостью по250 мл, каждую с 40 мл среды В. Каждую колбупрививают 1 мл культуры кз колбы посева. Колбыв.-тпяквэют прн 28 С со скоростью 220 об/мкн нашейкере в течеие 3 дней с пробами, выполкеннъьми в процессе ферментационного цикла, В пробахприменяют плавающий бульон, прошедший цектрк.фугкрованке, Получают следующие результаты:Возраст, час 48 53 72рН 6, 6,4 5,5Активность к 8 тарЬуососсыацгеоз АТСС 6538 Р,.размер зоны, мм 38 40 38Через 53 час бульоны кэ 13 колб собирают нфильтруют, рН порции фильтрата в 400 мл доводятдс 4,8 разбавленным НС к его адсорбируют на140 ьп; Довекс 50 х 2 йа при скорости 14 мл/мин.+Апсорбат промывают 200 мл деиониэированной воды и элюкруют 2%-ным пиридином в воде, собирая6 х 70 мл фракций. рН фракций доводят до 7,0Пробы брали ка всех фракциях.Пробы указывают ка 45%-ную активностьэлюатов.Элюатную фракцию сушат лри температуре ниже 0 С с получением 1 17 мг твердых веществ,Последние растворяют в 1,5 мл смеси л.бутклового спирта к воды (1:99). Раствор наносят на слойбиогеля Р=2 1,4 х 81,5 см, который предварительноуравновешивают смесью л.бутилового спирта ч во.(рН Дов.Дят ДО 7,31 Оприменением ЯЗОН)Температуру в баке доводят до 24 С в течение ,120 час. Добавляют не более 1% Дополнительного пе. ногасктеля полигликоля 2000, Проводят акпИактерий. ные пробы, 16400 л бульона фильтруют на пресс-фильтре и добавляют 1,2 г натриевой соли (зтилендннитрнло) тетрауксуснои асислоты к фильтрату, Фильт 1 т охлаждают до 6 С доводят рН до 4 О Я) 2 и поддер, хивают при 6 С. .Олодн 1 й цильтрат адсорбиру 1 с: на 38 л Довекс 50 х 4 Иа 20 - 50 меш при скорос4 арми 1. Асорбат промьа 1 от 40 мл деИО 1 п.Знрсьани 04 ВО;.,О 1 злюирчбт 2%-:гь 1 м водным 1 олди "1 ом т 1; рр 1, ,9 Г ълуаяпЯрт щ:-ООР/И 1 ., ЗО Т -.ЛИТЫЕ 1 РОЬ ЛО -Жа . чГО З 1 пат фрак-.чдй 2 1 3 содерхЗ 1 т 22% ак.ность 1 рк фракции собирают концентрируют до 38 л к доводят рН до I, 3,8 л полученного выше кощлпрата . согЖ 1 у 1 эт ка 2,5 л Довекс (смола хлорил. ного цикла) прк скорости 2(Й мл/мкн. Смолу 30 33 ПОИРСЮТ ДЕ 11 ОНИЗИРОВакной ВОДОЙ В ТОМ ЛК КОЛЛ- честве. Фракции собирают и каждую доводят д. рН 7,0, Пробы Г.оказьза 1 ОТ 75%-ную биоакл 1 вмост 1фрЗКщцХ8 т фраКлК СЯНра 1 Ст и фи - ,. руют 3 л 1 орпии Ого фильтрата унта прк теьэ. р эа=;ое ниже ОС пол;чают 1 о 6 г твердых вед " - ., с активна-, ъ.э 70 едмг.и г еь 1 сп 1 е нного при тепиратуре ниже О твердого ве 1 цесва соединяют с 50 мл 0,1 М 2,6- лутилпсацетатного буфера. Раствор с рН 6,3 накосят,р ю колонсу, получе 1 п 1 ую следующим образом.2,5 л Довекса 50 х 8 (200-400 меш) смоль водородного цикла преобоазуют в 2,6 . лутк 1 п 1 нсвый тллкл. Смолу уравновепивают с 5 обы:маьз колонки 2,6 лутидинацетатного буфера, 0,1 М 46 рН 6,3. Размеры уравновешенной смолы в слое 5 х 114 сьь Колонку проявляют буфером (0,1 М) со скоростью 14 мл/мин.Поток элюекта направляют зал 1 сываюпзм диф. ,ференш 1 а.1 ь:.Гым рефрактором Меккоматик. Просе. Ж ляют до получения 220 фракций ло 20 мл каждая, Каждую сле 11 ую 1 цую фракцию от 44 до 142 опробируют при разбавлении 1:50. Биоактивкость наблюдаеся во фракциях 78 - 136, максимальная во фракциях 92 - 94, Фракции 82 - 116 отбирают и бб собирают с получением 700 мл раствора. Раствор разделяют на две порции 350 мл и сушат при температуре ниже 0 С.Одну порцию выселенных веществ растворяют в 2,6 . луткдикацетатном буфере, 0,1 М, рН 7,0. 60 12Раствор 27 мл наносят на колокку биогеля Р 2(200 - 400 меш) 5 х 108 см, которую предварительноуравновешивают буфером (0,1 М) . Гель затем про.являют буфером при скорости 10 мл/мин.Поток злюента направляют записываяицим дифференциальным рефрактометром Иаккоматмк.Проявле 1 п 1 е лродоляают до получения 105 фракций(20 мл каждая), фракции собирают Каждую фра:цню 5 1 - 90 опробируют щж резбввлеиии 1:50. Про.ба показь 1 вает пик биоактивности во фракциях67 - 75, максимум в 70 ч 71. Фракцвз 1 68 - 75 соби.рают с полущнием объема 162 мл. К 145 мл собранной фракции добавлявзт 3 мл (рН 7,0) буфера фосфатв в 1 атрил р раствор упцентрируют до 9 у 1Концентрат с содеряанием 78% об 1 цего биоактивного материала наносят иа колонку биогеяя Р,сушат при температуре ниже 0 С с полумнием185 ьп. Оствв 1 пиеся 17 мл фракций 68-75 с"гтпри температур юаж ОС с подулнззм ";,9 млтвеэдых ве 1 цеств с актюностьго 1050 ед/мг,П р н м е р 5. Трубку с ллоф 1 лизооаннЫ1 ГЬ 1 О ЯТ л Тол,л ЭТа, .СОГЗЗт .лтт.л 1 -л": В - .л - .- 1 -ц оп За.СОЕДЬ 1;":тЭ" д л-1-л -лр 1 ме оаНнокувзрованные косяки по 1 рериют ижуоа.цик в течение кедели при 28 С и затем хрмитпри 4 .10 .лл среды А асептичнО перен.сит вп О "косяков, Гло 1 эы и БозупчЪЖ мецезжй яомб 1 цй ах иСУ --- . - - Л 1 ОСДН 1 СПОЛЬЗУТД ДЛУ"КЯЦП" ЛЕ;.лРОО, Щс-,У т%Зл. ч эл,.у"л 500 Г -э"О"л."Г: эт лрк,зсо скспостью 60 Обья11 ЕЬз ОЕ В ТЧЕРк "Тасю11 ЬЬТ 7 у , КОл нФЦ;-"тд Ьзр: о д 1."иноксЯш 1 бака емкостью,".ь л из жпжаветоше 11А лст л 1 с эдер(ап е 1 о 1 Ос,еды 1 еьпетатурубаке доночт до 28 С пеоеме 1 тзают со дидростью150 об/мин, пропуская поток воздуха в течение14 час, Пеногасктель - цсапгл 1 каль ЗХВ нспользуют в количестве не более 1 с, ОН нсеьлетсяСЛЕдулОППП 1 ОбразОМ:Возраст, час О, 12 24рк 6,3 6,6 5,35 л ку 1 ьуоы из бака посева ипользуют дгя1 Поупя 1 П рЭМТЕ; . ю,П.СТЬл 56 -жавеющей стали, содепжс цеГО 46 л со"цьл,: композиции примера 4.о;,Процесс проводят при 24 С прн скорострпере.мешивания 95 об/мвн в течение 120 час, Пеногаси.тель - полкгжпсоль 2000 Добавляют в коглчествене более 1,1%.400 л бульона фкльтоуют через фильтр-пресс ипорошок для фкльтрова 1 пя добавляют к 1,2 г (зтилендинитрило) . тетрауксусной кислоты, к фильтрату добавляют соль натрия. Фильтрат Охлаждаютдс 6 С, доводят до рН 4,0 1 0,2 и выдерживают20,0 г10,015,00,50,10,010,014,00,25 об%10 ЮОО мл Среда ЕЦерелозаКукурузная жидкость 25,0 ды. Гель проявляют смесью л.бутилового спирта иводы при скорости 1 мл/мин и собирают 2 мл фракций,Поток элюента направляют записывающим рефрактометром Меккоматик. Фракции опробируют наантибактерийную активность разбавлением 1:20.Биоактивный пик наблюдали на фракциях 44-53.Фракции 46 - 49 и половина фракции 50 собирают.1 мл образца последних фракций снова опробируюти остаток сушат при температуре ниже 0 С с выхо.дом 4,2 мг частично очищенного антибиотика.П р и м е р 3. Трубку с лиофилизованнойкультурой открывают асептично и содержимоевзвешивают в 0,8 мл стерильных солей Девисакомпозиции примера 1,Суспензию используют для инокуляции четырехкосяков среды А (плюс агар) композиции, указанной в примере 1.Привитые косяки подвергают инкубации в течение недели при 28 С и хранят при 4 С. Порцию спори воздушного мицелия одного из косяков исполь.зуют для прививки трех колб Эрленмейера(250 мл) с перегородками, каждая содержит 50 млсреды А. Три колбы с посевом встряхивают при28 С на шейкере со скоростью 220 об/мин в течение1 дня, получают удовлетворительный рост,12 колб Эрленмейера (2000 мл), каждая содержащая 250 мл среды С, прививают 7 мл суспензии,полученной с аптечным собиранием содержания3 колб с посевом, Среда С имеет следующую композицию (ч.); Среда СКукурузная мукаБардаСоевая мукаСаС 1 г 2 Нг ОМ 9804 7 НгОСоС 1 г 6 НгОЕе 804 7 НгОСасоПолигликоль 2000Дистиллированная вода(рН доводили до 6,5применением йаОН)Три колбы встряхивают при 28 С со скоростью 220 об/мин на шейкере в течение 72 час. Бульоны соединяют и часть центрифутируют для пробы, Собранный бульон имеет рН 7,4, антибактерийная проба с применением плавающего центрифугованного бульона - 43 мм.Бульон фильтруют, рН фильтрата доводят до 4,0 разбавлением НС, 3000 мл адсорбируют на 300 мл Довекс 50 х 21 ча при 30 мл/мин. Адсорбат промывают 300 мл деионнзированной воды и элюируют Ж-ным пиридином, собирая 8 х 150 мл фракций, рН фракций доводят до 7,0. Элюат фракций 2 и 3 (300 мл) соединяют и с содержанием 48% общего биоактивного материала наносят на колонку Довекс 50 х 2 Маз280 мл порции соединенных фракций элюата с рН 7,0, полученного выше, пропускают через ко. лонку (40 мл) смоляного цикла. Смолу промы.вают 160 мл деионизированной воды. Элюент ипромытые фракции собирают с получением 440 млраствора. Раствор доводят до рН 8,2 разбавлением5 гндроокисью натрия, концентрируют при пониженном давлении до 300 мл, доводят до рН 7,0 разбав.оченным КС и сушат при температуре ниже 0 С сполучением 189 мл твердых вешеств, которые раст.воряют в смеси и оутилового спирта и воды (1:99) .Ь 25 мл раствора наносят на колонку биогеля Р=(200 - 400 меш), который предварительно уравновешивают смесью п бутилового спирта и воды. Гельпроявляют и.бутиловым спиртом со скоростью6,7 мл(мин. Поток элюента направляют записы.15 ваюгцим дифференциально фм рефрактометром Меккоматик. 500 мл головного погона соединяют сфракциями (20 мл каждой). Каждую фракцию апробируют на антибактерийную активность при разбавлении 1:25. Биоактивность наблюдают во фрак 20 циях 37 - 42, максимум во фракции 39. Фракции38 - 41 общим объемом 80 мл собирают. Растворконцентрируют до 10 мл при рН 7,0 и сушат притемпературе ниже ОС, Твердое вешество (13,5 мг)имеет сравнительную силу в шесть раз больше, чем25 образец на биогеле Р =2 колонки в пробе сдисковой циффузией на Бтарпуососсца аогеоа.П р и м е р 4. Трубку с лиофилизованнойкультурой Ятгертогпусеэ сает еуа открывают септически и содержимое взвешивают в 0,8 мл сте 30 рильных солей Девиса компоэишги примера 1,Эту суспензию используют для прививки четырех косяков среды А (плюс агар) композициипримера 1,Привитые косяки подвергают инкубации в тече 35 ние недели при 28 С и затем хранят при 4 С.10 мл среды А асептически переносят на один иэкосяков, споры и воздушный мицелий помешают всуспенэию.3,3 мл суспензии используют для инокуляции40 2 л перегороженной колбы Эрленмейера с 500 млсреды А, Эту колбу с посевом встряхивают при28 С на шейкере со скоростью 160 об(мнн в течение48 час, получают удовлетворительный рост.Культуру из этой колбы с посевом используют45 для прививки. Й баке емкостью 190 л из нержавеющей стали, содержащем 160 мл среды А, проводятпроцесс при 28 С при перемешивании со скоростью150 об/мин в течение 24 час, Пеногаситель полнглнкот2000 используют в количестве не более 1%. рН из 9 меняется следующим образом,Возраст, час 0 12 24рН 6,4 4,4 0,343 л культуры в этом баке используют дляинокуляции 756 л ферментера нз нержавеющей стали, содержащего 467 л среды Е следующей композиции (г):576967 14 3при 6 С. Холодный фильтрат адсорбируют на 38 л Довекса 50 х 4 Ма (20 - 50 меш) при скорости 4 л/мин. Адсорбат элюируют 2%.ным водным пири. дином и три фракции (по 19 л каждая) собирают и опробируют. Пробы показывают 27%-ную биоак. тивность во фракциях 2 и 3. Элюат фракций 2 и 3 собирают, концентрируют до 3,7 л н доводят рН до 7.В 3,7 л концентрата элюата доводят рН до 7,4 и адсорбируют со скоростью 200 мл/мин, Смолу злюируют деинизированной водой с той же скоростью, фракции собирают, ловодят рН до 7,0. Фракцию 4 (4 л), содержащую 50% активности в концентрате, фильтруют через фильтр Миллипор 0,45 мкм. Светлый фильтрат высушивают при температуре ниже 0" С с получением 12,4 г твердого вещества с актив. костью 270 ед/мг,4 г высушенных при температуре ниже О С твердых веществ соединяют с 2,6. лутидинацетатным буфером, 0,1 М, рН 6,3. Раствор (50 мл) дово дят до рН 6,3 добавлением уксусной кислоты, наносят на колонку Довекс 50 х 8 2,6 - лутидинового цикла смолу (200 - 400 меш), которую предварительно уравновешивают буфером (0,1 М), Смолу проявляют тем же буфером 0,1 М, рН 6,3, при скорости 14 мл/мнн,Поток элюента направляют записывающим дифференциальным рефрактометром Мекк оматик. Проявление продолжают до получения 150 фракций (20 мл кидая). Другие фракции 72 - 150 опроби. руют при разбавленин 1:50, Единственный биоакгивный пик во фракциях 76 - 148, максимум во фракциях 92 - 102. Фракции 86 - 113 собирают с получением 580 мл раствора, содержащего 71% биоактивности при нанесении на колонку Довекс 50 х 8. Этот раствор подвергают сушке прн температуре ниже 0 С. Полукнный раствор растворяют в 2,6- лутидинацегатном буфере, 0,1 М, рН 7,0, с получением 25 мл, Раствор наносят на слой биогеля Р(200-400 меш), который предварительно уравновешивают буфером (0,1 М), Гель проявляют тем же буфером при скорости 9 мл/мии. Поток элюента направляют записывакицим дифференциальным рефрактометром Меккоматик, Проявление продол. жают до получения 105 фракций (по 20 мл каждая). Каждую фракцию 65 - 80 опробируют прн разбавлении 1: 200. Наблюдают биоактивиый пик во фракциях 67 - 76, Фракции 70 - 72 собирают и высушивают при температуре ниже 0 С с получением 16,0 мл раствора с активностью 13,800 ед/мг. Фрак. ции 69,73 и 74 собирают и высушивают при температуре ниже 0 С с получением 33,2 мг с активностью 5,200 ед/мг,16 г высушенных при температуре ниже 0 С веществ растворяют в 2,6. лутидинацетатном буфе ре, 0,1,М, с получением 10 мл, Раствор наносят иа слой биогеля Р(Шмеш) 5 х 108 см, который йредварительно уравновешивают тем же бу. фером. Гель проявляют буфером при .скорости 9 мл/мин, Поток элюента направляют записываю. щим дифференциальным рефрактометром Меккоматик, Проявляют до получения 105 фракций(каждая по 20 мл). Каждую фракцию 65 - 80 опробируют при разбавленни 1; 200,Биоактивный ник наблюдают во фракциях67-75, Фракции 68-72 собирают и высушивают притемпературе ниже 0 С с получением 9,1 мг с актив.костью 15,000 ед/мг.П р и м е р 6, Трубку с лиофилиэованнойкультурой Втгертапусеа саттеуа открывают асептически и содержимое взвешивают в 50 мл стерильной среды А (с композициеи примера 1), находя.щейся в перегороженной колбе Эрленмейера ем.костью 250 мл.Инокулированнуа колбу встряхивают при 28 Ссо скоростью 220 об/мнн в течение 48 час. 40 млбульона асепгично смешивают с 20%-ным стериль.ным гликолем. 2 мл полученной смеси пипеткойзакапывают в стерильную ампулу, затем замораживают и хранят на паровой. фазе холодильника сжидким азотом.Замороженное содержимое ампул используютдля кнокуляции перегороженной колбы Эрленме.йера (250 мл), содержащей 50 мл среды А; Колбу с25 посевом встряхивают цри 28 С со скоростью160 об/мин в течение 24 час.Порцию 10 мл из этой колбы с культуройиспользуют для инокуляцни перегороженных колбЭрленмейера (2 л каждая), содержащих 500 мл30 среды А. Эти колбы с посевом встряхивают соскоростью с 160 об/мин при 28 С в течение 24 час.Порцию 100 мл содержимого эшх колб нспользуют для инокуляцнн ферментера нз нержавеющейстали (756 л), содержащего 467 я среды А, Бак3, подвергают обработке при 28 С со скоростью130 об/мин в течение 24 час. Полиглнколь 2000 ис.пользуют в качестве пеногасителя в количестве веболее 0,1%.453 я культуры используют для инокуляции40 ферментера (5670 л) из нержавеющей стали, содержащего 4082 л среды Е композиции примера 4,Процесс проводят при 24 С при ско.рости вращения 70 об/мин в течение 144 час.Пеногаситель (полнгликоль 2000) добавляют ие4 ф более 0,1%, Пробы проводят с использованием плавающего центрифугированного бульона. Пробы иадисковую диффузию проводят с применениемфильтровальной бумаги,4,082 л ферментационного бульона фильтруютЖ Фильтрат охлаждают до 6 С, доводят рН до 4,5 Щ 2и поддерживают при 6 С. Холодный фильтрат ад.сорбируют. Адсорбат промывают 480 л денонизнрованной воды и элюируют 2%-ным водным пирндв.ном прн скорости 24 л/мин и три фракции 300, 526В н 240 л собирают и апробируют при рН 7,0. Пробыпоказывают, что злкат фракций содержит 4, 16 к6% (соответственио) биоактивности прн нанесенияна колонку Довекс 90 х 4 йа. Элюат фракции 2 концентрируют до 48 а аЮ доводят рН до 7.1 с48 л ксщентрата доводят дс рН 7,3 и адссрби. руют на 76 л Довекс 1 х 2 (50 - 100 меш) смолой хлоридного цикла при скорости 76 л/ьппь Смолу элюируют деионизировмщсй водой при той же скорости. Собирают 4 фракции, две по 48, орду 70 и одну 48 л, Фракции доводят до рН 7, Пробы пока. зывают, что 68% исходной бисактивнсстн присутствует во фракция 70 л, Зту фракжпс кокцентри руют дд 18 л при рН 7,0 и фильтруют с применв вием фильтра Миллипор 0,45 мкм, Фильтрат высу. шнвают при температуре ниже О С с получением 99 г продукта активностью 310 ед/кг.10 г высушенного при температуре ниже О С твердого вещества соединяют с 2,6. лутидинацетат. иым буфером, 0,1 М, рН 6,3. Раствор 125 мя довс дят до рН 6,3 уксусной кислотой и наносят на колонку, которую предварительно уравновешивают буфером и проявляют буфером (0,1 М) при скв рости 25 мл/мин. Каждую мтвертую фраиппс от 36 до 192 спрсбяруют при разбавления 1:200, Бисак. тннссть проявляется Во фрактрщх 56 - 192, максимум во фракцнях 92 - 96, Фракия 80 - 36 ссйъ рают, добавляют 590 мл деионизирсвашОй воды, получают 1760 мл. Собранный разбавлеичьй рас . вор содержит 62% исхолзгсй бисактивнссти, его наносят на колонку Дсвекс 50 х 8, сушат при темюратуре ниже 0 С.Высушенные при температуре низк: 0 С твердые леща ства р;1 оориот в,б лутидицацетатнс: буфере, 0,1 М, рН 7,0, Раствор 27 мл наносит на колонку биогеля Р(200 - 400 меш), которуюи едрзцч;., чц,в".тшгвают бубером (О,1 М) Гель проявляют тем ж буфером нри скорости 10 мл/мин,Лоток элюента направляют запясываюцчм шфференциальным рефрактомвтроьт Яакксматик По лучают 105 фракций (по 20 мл каждая), их собирают. Каждую фракцию 70 - 93 Опрсбяруют прн разбавлении 1:300. Биоактивность обнаружтсеают во фракциях 73 - 82, максимум во фракциях 77 и 73. Фракции 75-80 высуыивают п 1 и температуре ниже ОС с полущиием 90 мл антибисаиса со средней активностью 10,000 ед/мг. 90 мг его соединяют с 4 мл буфера фосфата кальки, 0,01 М, рИ 7. Зтот раствор, содержащий 596 ед гидроксилаьп.нгасжцей оптической плотностк, наносят на колонку с 90 мл предварительно промьпогс ХАД - 2 и уравновешенного до использования с 180 мл буфера фосфата кальция, 0,01 М, рН 7, при 5 С. ХАД - 2 промывают последовательно пятью объемами 1 н, 1 чаОН, затем деиснизированной водой дс получения нейтрального злюента, пятью объемами 1 н. ИС 1 н деионизированной водой до получения мйграпьно го элюента, пятью объемами (каждого) метанола, ацетона, 0,001 М ЗДТА тетранатрия и диспшлиро. ванной воды. Перед употреблением растворители вакуумируют,Далее образец наносят на колонку с двумя порциями фосфатного буфера по 2 мл. Колонку;плот с 2,6 . Лутндинацетатшм Оуферсм, ,.;рН 6,3. Раствор 125 мл доводят дс рН 63 пта.псВияцй уксусюси кйслсты наносчт на ксиснк7,бх 142 см Довекс 50 х 8 В щ:.ак 2,6 - ,тджх.-.г,гкоторую предварительно уравнсаецп-ваютферОм Колонку Бфпйзля%т 8%деэЯ 1 (0,1 Ь, и,"ссрс"ти 35 мл/ТББ 3 б л "ББсд"с БОГОВ ссбвдаЮТ и 330 фраКйяй ПО 2 ОМЛ КЪКдая. 2 Л.ф:четвертую фпаью От б БО 194 спрсбисую путразбавЯдции 1 2 ц 0 1 щсакщвпдруь об чФтцасФрициих1 " кснрп"е фо Ф акч п62 - 82. еракции 42-102 комбинируют и 640 млдеионизнрсванпой Всцы добавляют с иОлучеиием1920 мл. Соединевт".Й, разбавленвъгй раствсф, сс.дерЯжцгий 63% бииктивности, Заносят на кслснк 1Довекс 50 х 8 и вьгсуцшвают при темвратуре ниже ОС,Твердые вещества раствэяют в 2 б.лутпдчн.ацетатном буфере, 0,1 М, рН 7,0, Раствор 25 млнаносят на колонку 5 х 112 см бист ели Р(200-400 мин), предварительно у 1 жвновешекгуюбуфером (0,1 М), Затем гепа проявляют тем жебуфером при скорости 10 мл/мин,Поток элюента направляют записывающим р 4.ферешдальным рефрактометром Мек коматик.Проявляют до получения 125 фракций (каждая пс20 мл). Каждую фракцию 70 - 89 опрсбируют приразбавления 1:300. Биоактивиость обнарухивают 5 10 16 ЯО 25 прсявлякл прп э С буфером прн скорости поток 2 ш/мин. 4 мл фракций элюата собирают. Фракции, полученные после00 мл элюата, собирают и при получении 253 мл концентрируют на вращающемся устройства в вакууме и ниже 10 С до объема б мл.Этот раствор, содержащий 436 ед, гидроксиламивгасящей майской плотности, наносят на кс1 ч 90 ХАРтельно промьпой, как указано вымя, и уравнове.5 фС ст,1 д,ни д, Рд промывают двумя порциями по 2 л длстиллирс. ванной воды, Колонку проявляют г;стиллирсван. ной водой со скоростью 2 мл/ьпи, 4 мл фракше злюата собирают, Фракщги, нолучеячгые после 100 м злюата, собирают, 151 мл концентрируют на зсащающемся вьшарнсм устройстве дс объеь.а 2,73 мл и раствор лисфаызируют дс пслучеви 6,49 ми тненамищгна, фракрщ полуые мз 15 цр 52 мл г 315 мл Робярают и кэнцрртсируют ра Врзццщце 1 ся вытирнсм устройстве дс осъаьг 334 мл г лисфилизируют цс попучеьиЯ 1 1 3;, . Иь ".Лс. ота, Зти фсакцня содеркат в сб;цзь;, 369 ег г,т:, и:жснлаььжгасяе";яь члическс 4 ллзтич:к, .,о; "чаНВ Д Т Раэа УУП 1 ЕЦП Гй Ь"Е . чУС",;"да.;-Сьг маче 1 цталомнагг;г".1 "п 1 парв. - ; ..1 ку, получают активность 31,000 ед/мг. Оикгрсьзт ричесй аналтгз ос раз па продукта псказь виет Е 1 =253 прн иййе 1 книи в фосфатнсм буфера, СН 7, пр Сяч.576967 18 Формула и эо бре тенин СН - г.й(М 40 Сосввитель С МалитинаТехред НАндреячук Корректор С Ямалова Редактор Е. Хорина Заказ 2960/704 Тираж 541 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений н открыщй 113035, Москва, Ж - 35, Раушскаа наб.д.4/5Фвпил ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 во фракциях 72 - 81, максимум во фракцнн 77, Фракции 75-79 высушивают при температуре ниже 0 С с получением 100,5 мл антибиотика с активностью 8,320 ед/мг.100,5 мл твердого вещества соединяют с 4 мМ буфера фосфата кальция 0,01 М, рН 7. Этот раст. вор, содержащий 692 ед гндроксюамингасящей этической плотности, наносят на колонку (1,7 см диаметром) с 90 мл предварительно промытого и уравновешенного ХАД - 2 до использования с 180 мл буфера фосфата кальция, 0,01 М, рН 7 при 5 е С. ХАДпромывают до иакывэования пэ следовательно пятью объемами 1 н, йаОН, затем деионизированной водой до нейтрального злюента, пятью объемами 1 н.НС, затем деиониэароваиной водой до нейтрального элюента, пятью объемами метанола, ацетона, 0,001 М ЭДТЛ тетранатрня и затем дистиллированной водой. Вакуумнруют все растворители перед употреблением.Затем образец наносят на колонку двазды по 2 мл порциями фосфатного буфера. Колонку про. являют при 5 С буфером при скорости 2 мл/мин.4 мл фракций злюата собирают, Фракт 1 ин, получен. юю после 109 мл элюата собирают н после получения 309 м снова собирают, К этому знюату добавляют 1,53 мг обра:н 1 а ХАД - 2 очищенного акп. биотика, подученИого в примере 6 еодерд:пцего 185 ед гидроксиламингасящей оптической плот. ности.Собранный злюат вместе с добавленным антибиотиком концентрируют в вакууме на вращающемся выпарном устройстве при температуре низе 10 С до объема 7 мл.Этот раствор, содержащий 720 ед гидроксил. амннгасящей оптической плотности, наносят на колонку с 90 мл ХАД, предварительно промытой, как указано выню, и уравновешенной ври 5 С, Перед использованием образец промывают дважды дистиллированной водой (по 2 мл). Колонку проявляют дистиллированной водой со скоростью 2 мд/мин. 4 мл фракций элната собирают. Фракции, подученные после 109 мл элюата, собирают и после получения 309 мл концентрируют на вращающемся выпврном устройстве до объема 10,3 мл, Этот раствор, содержащий 589 ед гидроксиламингасящей оп. тической плотности, лиофнлизуют с получением 23,6 мг антибиотика с активностью 30,140 ед/мг. Полученный таким образом антибиотик пред. ставляет собой белое аморфное твердое вещество. Образец его помещают в ка 1 аллярную трубку, температуру повышают со скоростью 3 С/мин, про. исходит раэлояаиие без получения жидкой фазы на следующих стадиях: размягчение при 130 - 140 С; сокращение в объеме твердого вещества до 170-174 С, где материал желтел; интеживное нарастание цвета до красновато.коричневого при 180 - 200 С; карбонизацая и остаточные следы твердого вещества - при 205 С. Провй образец материала на анализе спектромурии показывает ник абсоазбции иа 296,5 нм сЕф= 268,2. Элементарный анализ дает аюдующиерезультаты: 5,67% потерь веса нри суи 1 ке при комнат.ной температуре в течение 4 час в вакууме. Композиция содержит (%) 47,68 углерода, 6,22 водорода,11,48 азота. Эти результаты совпадают с эмпиричес.20кон фоРмУлон С 1Н 1 а 1 з 048(ИНз) о та Вычисленная элементарная композиция содержит (%)С 47,68, К 6,13,М 11,52, 8 11,57, 0 23,1, Поляриметрнческий анализ 1 мг/мл раствора этого образца в10 мм буфера фосфата кальция показал спецнфн 25ческое оптическое вращение а+ 80,ИК - спектр этого образца выявнл характерный пикабсорбции на 1765, 1650 - 1 э 50 2800 - 2500 и3500-3100 см . Спектр ЯМР на 100 мГц образцаэтого продукта,Способ получения антибиотика тиенамицннаформулы отличающийся тем, что штамм Бтгертовусев саттеуа ййВ 8057 культивируют в аэробных глу. бинных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением и очисткой целевого продукта.