Способ получения 2-кето-d-глюкаровой кислоты

(5)5 С 12 Р 7/50, С 0 ИЕ ИЗОБРЕТ ОПИС К ПАТЕНТУ лениешестаисполные об Лтд ( Р) Ямачучи и ОНН Нгде, Я 1= -СНО, -СНгОН, -СООН; Я 2 - НСОН,НОСН, - СО, Окисление указанных соединенийпроводят штаммами бактерий нового вида Рзеос 1 од 1 исопоЬастег зассЬаго 1 етодепезК 591 с (ГЕЯМ ВР, ГГО 14464), или 12 - 5(ГЕЯМ ВР, 1 ГО 14466), или 12 - 15 (ГЕЯМВ Р, 1 ГО 14482), или 12 - 4 (ГЕ ЯМ В Р,1 ГО 14483), или 22 - 3 (ГЕЙМ ВР, 1 ГО а14484). Процесс окисления проводят при 2335 С, рН 6,0 - 7,5 в течение 50-100 ч, Содержание предшественника в среде 5 - 20мас. о, /объем. 2 ил., 2 табл,ФЩВ в О-О-ГЛ 10 асти технися способа й кислоты, на в качестовления де емента и в метаболизя - удешевк технической способа получеислоты, которая качестве добавия детергентов,в качестве реаизма сахаридов,В качеств глюкаровой к риды или их и е предшественника ислоты используют роизводные общейй 12НО-С-Н ке хаул Н-С-ОНСН 2-ОНгде Я 1,= -СНО, -СН 2 ОН, -СОЯ 2= НСОН, НО 6,=СО,а окисление проводят штаРзендод цсопоЬастег заК 591 с (ГЕЯМ ВР, 1 ГО(ГЕЯМ ВР, 1 ГО 1446 бактерий еодепез или 12-5 ТН 14 - 86 ммами семаго 14464) 5), или ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(57) Изобретение относится к облческой микробиологии и касаетполучения 2-кето-О-глюкаровокоторая может быть использоваве добавки к корму, для приготтергентов, пластификаторов цкачестве реагента при изучениима сахаридов, Цель изобретени Изобретение относитс микробиологии и касается ния 2-кето-О-глюкаровой к может быть использована в ки к корму для приготовлен пластификаторов цемента и гента при изучении метабол Известен способ получения 2-кето-Оглюкаровой кислоты микробиологическимокислением О-глюкаровой кислоты действием микроорганизма Рзеодощо пазаегмдпоза. О-глюкаровую кислоту получаютиз гл окозы химическим окислением.. Недостатком известного способа является высокая стоимость целевого продукта,Цель изобретения - удешевлениецеле="вого продукта,2елевого продукта. В качестве предника 2-кето-О-глюкаровой кислотьуют моносахариды или их производей формулыН ОН ОНй 1- й;с - с - с-сн,он,(ГЕВМ В Р,ГО 14466), или 12 - 5 (ГЕ ВМ ВР, ГО 14482), или 124-4 (ГЕРМ ВР- . 1131, =О 14483) или 22 - 3 (ЕЕЙМ ВР, ГО 14484) при 23 - 35 С, рН 6,0-7,5 в течение 50 - 100 ч и содержании указанных моносахаридов или их производных в среде 5 - 20мас/обьем.Штамм К 591 и штаммы 12 - 5, 12 - 15, 12 -4 и 22 - 3 выделены иэ образцов почв, собранных в префектурах Япония - Вакагама и Сига. Каждый из указанных штаммов имеет следующие таксономические признаки.Таксономические характеристики штаммов К 591 с и 12-5.Морфологйя,Клетки палочковидные размером 0,3- 0,5 х 0,7 - 1,4 мкм, Полиморфизм клеток не обнаружен. Клетки подвижные, имеют порядка 2 - 4 полярно расположенных жгутика.Споруляоия не обнаружена, Грамотрицательные, Некислотостойкие.Рост на различных средах.Питательный агар: рост слабый, На питательном агаре с дрожжевым экстрактомобразует круглую, сплошную, гладкую, опалесцирующую колонию. Скошенный питательный агар с дрожжевым экстрактом: рост средней степени. Образует нити, гладкие, опалесцирующие. Жидкая питательная сре- .да с дрожжевым экстрактом; рост среднейстепени, По всей поверхности среды образует однородную мутность.Столбик желатины с питательной средой: рост слабый, только в верхней части.Разжижения желатины не происходит, Лакмусовое молоко окисляет, Коагулирует.Физиологические признакиВосстанавливают нитрат, хотя слабо; денитрификация не обнаружена, Положительная проба метилкрасного, Индол и сероводород не образуются. Крахмал не гидролиэуется, Цитрат не утйлизируется.Соли аммония утилизируются. Пигментообраэования не обнаружено. Образует уреазу.Оксидазоположителен. Каталазоположителен, Растет в интервале 16 - 36 С. Оптимальная температура составляет примерно 10 1520253035 40 24-34 С. Растет в пределах рН 5,5 - 8,7, Оптимальное значение рН составляет примерно 6,0-7,5. 50Аэроб,Образует кислоту, а не газ иэ 1:араби- козы, О-ксилозы, О-глюкозы, О-фруктозы, О-галактозы, О-маннозы, мальтозы, сахарозы, лактоэы, трегалозы, О-маннита и глицерина. Не образует ни газа, ни кислоты из О-сорбита, инозита или крахмала,Другие характеристики.Образует уксусную кислоту из этанола, хотя в количестве следов. Рост зависит от биотина, тиамина, рибофлавина и кофермента А далее СоА), Образует диоксиацетон из глицерина. Содержание гуанина=цитозина в ДН К составляет примерно 67+ 1 мол,0, Содержит убихинон (кофермент О) с 10 изопреновыми единицами (Со 010). Устойчив к стрептомицину.Таксономические признаки штамма 12 - 15.Морфология,Клетки палочковидные размером примерно 0,3-0,5 х 0,7 - 1,4 мкм, Полиморфизм клеток не обнаружен. Клетки подвижные, имеют порядка 2 - 4 полярных жгутика, Споруляция не обнаружена. Грамотрицательные, Некислотостойкие,Рост на различных средах,Питательный агар: рост слабый, При культивировании на питательном агаре на дрожжевом экстракте образует круглую, сплошную, гладкую, опалесцирующую колонию. Скошенный питательный агар с дрожжевым экстрактом: рост средней степени, Образует нити ровные, опалесцирующие, Жидкая питательная среда с дрожжевым экстрактом: рост средней степени. Образует одинаковую мутность по всей поверхности среды, Столбик питательного желатина: рост слабый, только в верхней части. Разжижения желатина не происходит, Лакмусовое молоко окисляет, коагулирует.Физиологические характеристики, ф Нитрат не восстанавливает. Денитрификация не обнаружена. Положительная проба метилкрасного. Индол и сероводород не образует. Крахмал не гидролизует. Цитрат не утилизирует. Утилизирует соли аммония. Пигментообразования не обнаружено. Образует уреазу, Оксидаэоположителен. Каталазоположителен, Растет в интервале 23-32 С, Оптимальная температура составляет примерно 28 - 32 С. Растет в пределах рН 6,0 - 7,5, Оптимальное значение рН составляет примерно 6,5 - 7,1.Аэроб.Образует кислоту, а не газ из 1:арабиноэы, О-ксилоэы, О-глюкозы, О-фруктозы, О- галактозы, О-маннозы, мальтозы, сахарозы, лактозы, трегалозы и глицерина. Не образует ни кислоты, ни газа из О-маннита, О-сорбита, инозита или крахмала,Другие характеристики,Образует уксусную кислоту из этанола, хотя в количестве следов. Рост зависит от биотина, тиамина, рибофлавина и СоА. Образует диоксиацетон из глицерина, Содержание гуанина+цитозина в ДНК составляет порядка 67+ 1 мол.,. Содержит убихюнонс 10 изопреновыми единицами (Со 01 о). Устойчив к стрептомицину,Таксономическиепризнаки штамма 12 - 4,Морфология; 5Клетки палочковидные размером 0,30,5 х 0,7 1,4 мкм. Полиморфизма клеток необнаружено, Клетки подвижные, имеют 2 - 4полярных жгутика. Споруляция не обнаружена. Грамотрицательные, Некислотостойкие,Рост на различных средах,ПитательНый агар: рост только очень не-большой колонии, полный обзор невозможен. При культивировании на питательном 15агаре с дрожжевым экстрактом образуеткруглую, сплошную, гладкую, опалесцирующую колонию,Скошенный питательный агар с дрожжевым экстрактом, рост средней степени, 20образует нити ровные, опалесцирующие.Жидкая питательная среда с дрожжевымэкстрактом; рост средней степени с образованием однородной мутности по всей поверхности среды. Столбик питательного 25желатина: рост скудный, только в верхнейчасти, Желатин не разжижается, Лакмусовое молоко окисляется, но не коагулирует,Физиологические характеристики.Не восстанавливает нитрат. Денитрификация не обнаружена. Положителен впробе метилкрасного. Индол не образуетСероводород образует, Крахмал не гидролизует. Цитрат не утилизирует. Утилизируетсоли аммония. Пигментообразование не обнаружено. Образует уреазу, Оксидазоположителен, Каталазоположителен,Растет в интервале 16-36 С, оптимальная температура составляет 24-34 С. Растет в интервале значений рН 5,5-8,2. 40Оптимальное значение рН составляет 6,07,5,Аэроб.Образует кислоту, а не газ из Е-араби-.нозы, О-ксилозы, О-глюкозы, О-фруктозы, 45О-галактозы, О-маннозы, мальтозы, сахарозы, лактозы, трегалозы и глицерина. Не об разует ни кислоту, ни газ из О-маннита,О-сорбита, инозита или крахмала,Другие характеристики. 50Образует уксусную кислоту из эталона,хотя в количестве следов, Рост зависит отбиотина, тиамина, рибофлавина и СоА илипантотеновой кислоты. Образует диоксиацетон из глицерина, Содержание гуанина+ 55цитоэина в ДНК составляет порядка 67+ 1мол,0. Содержит убихинон с 10 изопреновыми единицами (Со 010). Устойчив к стрептомицину. Таксономические признаки штамма 22 Морфология.Клетки палочковидные размером 0,30,5 х 0,7 - 1,4 мкм. Полиморфизм клеток необнаружен. Клетки подвижные с 2 - 4 поляр- .ными жгутиками. Споруляция не обнаруже- .на. Грамотрицательные. Некислотостойкие.Рост на различных средах.Питательный агар; рост только очень небольшой колонии, полный обзор невозможен. При культивировании на питательномагаре с дрожжевым экстрактом образуеткруглую, сплошную, гладкую, опалесцирующую колонию, Скошенный питательныйагар с дрожжевым экстрактом: рост среднейстепени, Образует нити ровные, опалесцирующие.Жидкая питательная среда с дрожжевым экстрактом: рост средней степени с образованием одинаковой мутности по всейповерхности среды. Столбик питательногожелатина; рост скудный, только в верхнейчасти, Разжижение желатина не происходит, Лакмусовое молоко окисляет, но не коагулирует.Физиологические характеристики.Восстанавливает нитрат, хотя слабо,Денитрификация не обнаружена. Положительная проба с метилкрасным. Индол и сероводород не образует. Крахмал негидролизует. Цитрат не утилизирует. Утилизирует соли аммония, Пигментообразование не обнаружено, Образует уреазу.Оксидазоположителен. Каталаэоположителен. Растет в интервале 16-38 С, оптимальная температура составляет 24 - 34 С.Растет в интервале рН 5,5-8,7, Оптимальноезначение рН составляет 6,0-7,8.Аэ раб.Образует кислоту, а не газ из-арабинозы, О-ксилозы, О-глюкозы. О-фруктозы, Огалактозы, О-маннозы, мальтозы, сахарозы,лактозы, трегалозы и глицерина. Не образует ни кислоты, ни газа из О-маннита, О-сорбита, инозита и крахмала,Другие характеристики.Образует уксусную кислоту из этанола,хотя в количестве следов, Рост зависит отбиотина, тиамина, рибофлавина и СоА илипантотеновой кислоты, Образует оксиацетон из глицерина. Содержание гуанина +цитозина в ДНК составляет порядка 67+ 1мол.0. Содержит убихинон с 10 изопреновыми единицами (Со Ою). Устойчив к стрептомицину.Штаммы К 591 с, 12-5, 12-15, 12-4 и 22 - 3не принадлежат к известным родам, а представляют новый бактериальный вид нового1753949 5 10 20 25 30 35 40 45 50 рода, названный РзецбодцсопоЬас 1 ег зассЬаго 1 есодепез.Указанные бактериальные штаммы в некоторых случаях обозначаются как окисляющие бактерии, Их потребности в питании для роста следующее,У штаммов К 519 с, 12 - 5, 12 - 15 необычные потребности в питании, т,е, для роста им необходим СоА, В указанных трех штаммах кофермент А нельзя заменить. пантотеновой кислотой, Штаммы 12 - 4 и 22 - 3 могут расти в присутствии СоА и/или пантотеновой кислоты.Бактериальные штаммы включают также мутанты, полученные путем облучения указанных штаммов ультрафиолетовыми и рентгеновскими лучами или обработкой их химическими мутагенами, например Й-метил-К-нитро-Й-нитрозогуанидином (нитрозогуанидином), метилметансульфонатом или азотсодержащей горчицей.Примером мутанта является штамм ТН 14 - 86, который получен из штамма К 591 с путем обработки нитрозогуанидином, Этот штамм имеет таксономические характеристики, аналогичные материнскому штамму,за исключением того, что он обнаруживает повышенную способность образовывать 2- кето-О-глюкаровую кислоту из сахаридов.Штаммы К 591 с, 12 - 5, 12-15, 12-4, 22-3 и ТН 14 - 86 сданы на хранение в Институт по ферментации, Осака (1 ЕО), а также в Исследовательский институт ферментации (ЕЕЙМ) Агентства Промышленной науки и технологии Министерства международной торговли и промышленности, На основании Будапештского Договора указанные микроорганизмы хранятся в ЕЯ 1,Депозитарные номера микроорганизмов представлены в табл,1,Соединения, которые используют в изобретении в качестве предшественника, включают О-глюкозу, О-фруктозу, О-маннозу, О-сорбит, О-маннит, О-глюконовую кислоту, 2-кето-О-глюконовую кислоту, О-глюкозон и О-манноновую кислоту (указанные соединения далее сахариды),Сахариды можно вводить в среду либовначале культивирования несколькими порциями, либо непрерывно в течение всего процесса культивирования, Концентрация сахаридов в реакционной жидкости должн 1 составлять 5 - 20 мас,0/объем,В реакционной жидкости значение рН устанавливают в пределах 5,5 - 7,5. Температуру и время реакции окисления. поддерживают в интервале примерно 23 - 35 оС и около 50-100 ч. Культуральная среда может быть либо жидкой, либо твердой. В среду включают источники углерода, азота, мине 8ральные и органические кислые соли и питательные вещества в количестве следов, Сахариды можно использовать в качествеисточников углерода без обработки. Как дополнительные источники углерода могутбыть использованы глицерин, сахароза,лактоза, мальтоза, меласса,В качестве источников азота в средувключают соли аммония (сульфат, нитрат,хлорид, фосфат), кукурузный экстракт(далееСЯ.), пептон, мясную вытяжку, дрожжевойэкстракт, сухие дрожжи, соевую муку, мукуиз семян хлопка и мочевину. Минеральныесоли включают соли калия, натрия, кальция,магния, железа, марганца, кобальта, цинка,меди.Питательные вещества, которые используют в количестве следов, включают витамины, необходимые для роста указанныхбактерий, например СоА; пентотеновуюкислоту, биотин, тиамин и рибофлавин, атакже соединения со стимулирующим действием на рост бактерий и продуцирование2-кето-О-глюкаровой кислоты,. напримерфлавин-мононуклеотид (ФМН), флавин-адениндинуклеотид (ФАД), другие витамины, 1:цистеин, 1-глутаминовая кислота итиосульфат натрия в виде либо химическихсоединений, либо природных веществ, которые их содержат.Культивирование бактерий проводятиметодами статического культивирования,встряхивания в колбах, глубинного культивирования. Условия культивирования зависят от бактериального штамма, составасреды и других факторов, В качестве компонентов среды могут использоваться стерилизованные бактериальные культурыВасИцз сегецз 1 ЕО 3131Вас 1 Ицз зцЬсИ 1 з 1 ЕО 3023Васйцз рцгпИцз 1 ЕО 12089Васйцз тедасег 1 цгп,1 ЕО 12108Вас 1 Ицз апту 1 оИцце 1 ас 1 епз 1 ЕО 3022Рзецс 1 огпопаз тгИоИ 1 ЕО 12056СтгоЬастег ЕгецпсИ ЕО 12681ЕзсЬег 1 сЫа соИ 1 ЕО 3546. Епм 1 па ЬегЬ 1 соа ЕО 12686Культуру указанных бактерий высеваютв соответствующую среду, выращивают при20 - 40 С в течение четырех дней и послестерилизации полученный бульон добавляют в среду окисляющих бактерий в соотношении 0,5-5,0% (объем/объем).2-Кето-О-глюкаровую кислоту, котораяобразуется и накапливается в реакционнойжидкости, выделяют и очищают традиционными способами. При этом 2-кето-О-глюкаровую кислоту получают в виде свободнойкислоты либо соли натрия, калия, кальция,аммония, Например, бактериальные клеткиудаляют предварительно из реакционной сокоэффективной жидкостной хроматогражидкости фильтрацией или центрифугиро- фии, конечный культуральный бульон содерванием. В случае необходимости осуществ- жит 9,02 мг/мл 2-кето-О-глюкаровой ляют обесцвечивание активированным кислоты, Для удаления бактериальных клеуглем. Затем раствор концентрируют до 5 ток указанный культуральный бульон (590 осаждения кристаллов, Образующиеся кри- мл) центрифугируют и получают 580 мл надсталлы собирают и перекристаллизовыва- осадочной жидкости, Образующуюся надют. осадочную жидкость пропускают черезПродукт, полученный согласно изобре- колонку с катионообменной смолой В 120 В тению, идентифицирован как 2-кето-О-глю в Н+-форме, после чего для удаления катиокаровая кислота путем определения нов колонку промывают 150 мл деионизофизико-химических свойств (элементного- ванной водй, Далее надосадочную состава, точки плавления, вращения пло- жидкость пропускают через колонку с акти- скости поляризации) и ИК-спектра., вированным углем (70 мл), колонку промыВ результате высокоэффективной жид вают 50 мл деионизованной воды, затем костной хроматографии проведен количест- элюент (780 мл) доводят до рН 6,5 с повенный анализ 2-кето-О-глюкаровой мощью Са(ОН)г, послеудаления белоймути кислоты. Подвижная фаза; разбавленная фильтрацией его концентрируютдо пример- серная кислота. рН 2,2; скорость потока 0.5 но 20 мл при пониженном давлении.мл/мин; детектор: дифференциальный ре Образуемые в концентрате белые аморфрактометр; колонна с насадкой из сульфи- фные кристаллы собирают на стеклянный рованного полистирольного геля (колонна фильтр, промывают последовательно не- типа ЯСВ - 101 Н, размер 7,9 мм х 30 см), Вбольшими порциями холодной воды, мета- качестве стандартного образца использова- нола и этилового эфира и высушивают при на известная 2-кето-О-глюкаровая кислота. 25 пониженном давлении. Получают 5,04 г 3,5 Изобретение позволяет получать 2-ке- гидратированного дикальций-кето-О-глюто-О-глюкаровую кислоту с высоким выхо- карата. Аналитические данные полученного дом, и родукта следующие.На фиг.1 и 2 показана инфракрасная Точка плавления: 152-157 С (разложеобласть спектров поглощения кристалличе ние).ского вещества, полученного в примере 1, иДанные элементного анализа:стандартного образца, полученного в конт- - Вычислено, %: С 23,30; Н 4,24: Са 12,96, рольном примере,. СбН 60 эСа 3,5 Н 20П р и м е р 1 (контрольный); 30 мл среды, Найдено, %: С 23,15; Н 4,18; Са 14,00, состоящей из, %: пептон 0,5; дрожжевой 35 Удельное вращение плоскости поляриэкстракт 0,5; О-глюкоза и К 2 НРО1,0(далее зации (а)о =-+9,0(с = 1,075, 0,1 н НС), ПДГ-среда), помещают в 200.мл коническую ИК-область спектра поглощения; волноколбу и автоклавируют при 120 С в течение вые числа главного поглощения имеют сле мин. В указанную колбу вносят "полную дующие значения:петлю" свежих клеток Рэеодотопаэ 40 волновое число, см: 3590, 3500-2700 аегвдпоэа (ЕО 3448), выращенных йри (шир), 1650, 1600,1430,28 С в течение двух дней на скошенном" 1380, 1360, 1300, 1250, 1240, 1220, 1125, агаре, который приготовили путем введения 1095,в среду ПДГ 2% агара, Затем бактериальные 1065, 1040, 1005, 995, 900. 840, 800, 765, клетки выращивают путем встряхивания с 45 725,вращением(200 об,/мин) при 30 С втечение П р и м е р 2. 20 мл среды для посева, 24 ч. В качестве посевной культуры исполь- состоящей иэ 2,0% О-глюкозы, 1,0% пептоэуют полученный культуральный бульон, на, 1,0% сухих дрожжей и 2,0% СаСОз, по 5 мас,%/объем водногораствора моно- мещают в 200 мл коническую колбу и калиевой соли О-глюкаровой кислоты, пред автоклавируют в течение 20 мин при 120 С, варительно доведенного до рН 7,0 с В укаэанную колбу инокулируют одну "полпомощью МаОН, фильтруютчерез пористый ную петлю" клеток штамма фильтр с размером пор 0,45 мк для удаления РэецдодосопоЬастег эассЬагоМесодепеэ микробов, послечегоприбавляютего в ПДГ- В 591 с (РЕЯ ВР, РО 14464), выращенсредедо концентрации 1 мас.%/объем, 1 мл 55 ных при 28 оС в течение четырех дней на указанного посевного культурального буль- скошенном агаре, состоящем из, %; О-сорона переносят в 200 мл коническую колбу, бит 2,5; пептон 1,0; дрожжевой экстракт 1,0; содержащую 20 мл указанной среды, и вы- СаСОз 0,2 и агар 2,0, с последующим кульращивают с встряхиванием в течение 24 ч тивированием с встряхиванием (200 при 30 С, Как обнаружено в результате вы- об./мин) при 30 С в течение дьух дней с5 10 15 30 35 40 45 50 55 получением культурального бульона с посевньмматериалом, Отдельно 200 мл среды, состав которой аналогичен указаннойсреде для посева, помещено в 1 л коническую колбу и простерилизовано при такихже условиях, как указано. После этого в указанную колбу переносят 10 мл культурального бульона с посевным материалом изатем проводят культивирование с встряхиванием при 30 С в течение трех дней,Образующийся культуральный бульонсодержит 19,4 мг/мл 2-кето-О-глюкаровойкислоты. Этот культуральный бульон (1600мл) центрифугируют (7000 об,/мин в течение 10 мин) для удаления осадка, содержащего бактериальные клетки, и получают .1520 мл надосадочной жидкости. После охлаждения до 4 С ее выдерживают в течениетрех дней. Получают аморфные кристаллы2-кето-О-глюкарата кальция, Образующиеся кристаллы собирают на стеклянном фильтре, промывают последовательнонебольшими порциями холодной воды, метанола и этилового эфира, высушивают надпятиокисью фосфора при пониженном давлении. Получают 18 г тригидратированногодикальций-кето-глюкарата, Аналитические данные конечного кристаллическогопродукта следующие,Точка плавления: 152-157 С (разложение).Данные элементного анализа:Вычислено,;6: С 24,00, Н 4.03, Са 13,35.СбНвОвСа ЗН 20Найдено, 0: С 23,96, Н 4,16, Са 13,00.Удельное вращение плоскости поляризации света: (а)о = +7,9 (с = 1,065, 0,1 иН С).И К-область спектра поглощения:волновое число, см : 3590, 3500, 34002700 (шир.),1650, 1600, 1430, 1380, 1360, 1300, 1250,1240, 1220, 1125, 1093, 10650, 1040,1005,995, 995, 900, 840, 800, 765, 725.Указанное кристаллическое вещество истандартный образец имеют одинаковыйИК-спектр (фиг,1 и 2 соответственно), однои то же время удерживания (9,4 мин) привысокоэффективной жидкостной хромэтографии и одинаковое отношение поглощения ультрафиолетовых лучей при 214 нм кпоказателю дифференциальной рефракции(примерно 1,0). Кристаллическое вещество истандартный образец подвергают тонкослойной хроматографии при комнатной температуре в течение 3 ч, используяцеллюлозную пластину Мечск и смесь, состоящую из фенола, муравьиной кислоты иводы(75:5:25). Оба образца имеют одинаковое значение Ю, кроме того, проявляют себя одинаково в реакциях окрашивания: оба меняют цвет до черновато-коричневого, желтого и желтого при взаимодействии с нитратом серебра, о-фенилендиамином и анилинофталевой кислоты соответственно. На основании указанных аналитических данных продукт идентифицирован как 2-кето-О-глюкаровая кислота.П р и м е р 3. Используя методику примера 2, готовят культуральный бульон штаммов К 591 с (РЕВМ ВР, РО 14464), 12 - 5 (РЕВМ ВР, 1 РО 14465), 12-15 (РЕЯМ ВР,РО 14482), 12 - 4 (РЕВМ ВР, 1 РО 14483) и 22-3 (РЕВМ ВР, 1 РО 14484),Сбраживаемую среду получают путем добавления сахридов при концентрации 5 мас.0 ф /обьем (табл.2), предварительно простерилизованных, в сред (рН 6,5), состоящую из, ф: кукурузный экстракт 0,5; сухие дрожжи 0,5; сульфат. аммония 0,5; сульфат натрия 0,05; сульфат железа 0,2 и СаСОэ 3,0.1,25 мл культурального бульона каждого штамма переносят в 200 мл коническую колбу, содержащую 25 мл укаэанной среды, и культивируют с встряхиванием при 30 С в течение трах дней. Полученный культуральный бульон разбавляют 0,3 и серной кислотой и центрифугируют. Г 1 осле этого образующуюся надосадочную жидкость подвергают высокоэффективной жидкостной хроматографии для определ 4 ййясодержания 2-кето-О-глюкаровой кислоты. В табл,2 представлен количественный выход 2-кето-О-глюкаровой кислоты(мг/мл).Время удерживания при жидкостной хроматографии высокой разрешающей способности и величина В при тонкослойной хроматографии полученного продукта равны 9,4 мин и 0,20 соответственно, что соответствует значениям стандарта,П р и м е р 4. Среду (500 мл), состоящую иэ 2,0% О-глюкозы, 1,0; пептона, 1,0 , сухих дрожжей, 2,00 карбоната кальция и 0,01 6 актокола (антивспенивающий агент), помещают в двухлитровую колбу и автоклавируют при 120 С в течение 20 мин. Бактериальные клетки штамма 12-5 (РЕВМ ВР, 1 РО 14465), выращенные при 28 С в течение четырех дней на скошенном агаре,суспендируют в 10 мл стерильной воды. Полученную суспензию переносят в указанную колбу, после чего проводят культивирование с встряхиванием (85 встрях./мин) при 28 С в течение двух дней с получением культурального бульона для использования в качестве посевной культуры,1753949 1 Г 14 14 14 Отдельно суспендируют в 10 мл стерилизованной воды бактериальные клеткиВас 111 цз тедатег 1 цт (1 ЕО 12108), выращенные при 28 С в течение двух дней на скошенном агаре (состав среды описан в 5примере 2). Образованную суспензию инокулируют в колбе, в которой содержится такая же среда, после чего ее подвергаюткультивированию с возвратно-поступательным встряхиванием (84 встрях./мин) при 1028 С в течение двух дней с получением культурального бульона Вас 111 цз тедатег 1 цт.30 л среды (рН 7,0), состоящей из,сахароза,4,0; мука из семян хлопка 4,0;К 2 НРО 4 0,65; КН 2 РО 4 0,55; сульфат аммония 150,05; 1 чаС 1 0,05; сульфат магния 0,05 и пантотенат кальция 0,05, помещают в 50-литро вый ферментер и автоклавируют при 125 Св течение 20 мин. 1 и бульона с посевнойкультурой Вас 1 Пцз гпеда 1 ег 1 цв помещают в 20укаэанный ферментер и культивируют в течение четырех дней при,28 С и внутреннемдавлении 1,0 кг/см в условиях аэрации содновременным перемешиванием (200об./мин). Полученный культуральный.бульон стерилизуют паром при 120 С в течение20 мин, хранят в прохладном месте и используют в качестве стерилизованной культуральной жидкости Вас 1 Ицз ведмег 1 цвкак компонента сбрэживаемой среды. 30120 л сбраживаемой среды, состоящейиэ, : О-глюкоза 10,0; пептон 1,0; сульфатжелеза 0,1; 1-цистеин 0,01; карбонат кальция 6,08; 1 мкг/мл ФМН, 1 мкг/мл гидрохлорида тиамина, 0,5 мкг/мл биотина, 0,02 35актокола и 4,0 указанного стерилизованного культурального бульона Вас 111 цзведасег 1 ц гп,помещают в 200-литровый ферментер, стерилизуют при 125 С в течение 20мин, 10 л.бульона с посевной культурой по-. 40мещают в ферментер и культивируют при28 С и давлении 1,0 кг/см. при аэрации 96л/мин в течение четырех дней с перемешиванием.при скорости 200 об,/мин, Полученный культуральйый бульон содержит 99,3 45мг/мл 2-кето-О-глюкаровой кислоты,Указанный культуральный бульон (110л), очищенный в центрифуге (1500 об,/мин),дает примерно 31 кг мокрого осадка, Егопромывают 150 л воды, центрифугируют(3000 об./мин), суспендируют в 30 л ацетона, центрифугируют (3000 об,/мин). Получают порошок белого цвета, которыйвысушивают при 50 С в течение 24 ч припониженном давлении. Степень чистотыполученного неочищенного порошка составляет 58,9 в расчете на свободную 2 кето-О-глюкаровую кислоту.Формула изобретенияСпособ получения 2-кето-О-глюкаровойкислоты, включающий окисление предшественника 2-кето-О-глюкаровой кислоты действием микроорганизма в среде, содержащейисточники углерода, азота, минеральные солии ростовые вещества, с последующим выделением целевого продукта иэ культуральнойжидкости, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью удешевления целевогопродукта, в качестве предшественника 2-кето-О-глюкаро-вой кислоты используют моносахаридыили их производные общей формулыВ2НО-С - НН-С-ОНН - С - ОНСН -ОНгде Б - -СНО, -СН 2 ОН, - СООН,82 = НСОН, НОСН,СО,а окисление их проводят штаммами бактерийРзецдод 1 цсопоЬастег зассЬагоКе 1 одепез К 91 с(ЕЕВМ ВР, 1 ЕО 14464), или 12 - 5 (ЕЕВМВР, 1 ЕО 14465), или ТН 14 - 86(ЕЕВМ ВР 1128, 1 ЕО 14466), или 12 - 15 (ЕЕ ЯМ ВР,1 ЕО 14482), или 12 - 4 (ЕЕЯМ ВВ, 1 ЕО14483), или 22 - 3 (ЕЕЯМ ВР, 1 ЕО 14484)при 23 - 35 С, рН 6,0 - 7,5 в течение 50 - 100 ч исодержании указанных моносахаридов илиих производных в среде 5 - 20 мас, ,/объем.Таблица 1. Редактор И,Шуллал Корректор О,Густи Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 2777 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5