Способ получения фракции на, содержащей защитный антиген воrdетеllа реrтussis

(51) 39/ ЕТЕНИ ц АТЕЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Джуридикал фаундейшн дзе Кемосеро-терапевтик рисерч институти Тейдзин Льмнтед (ЗР)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРАКЦИИ НА,СОДЕРЖАЩЕЙ ЗАЩИТНЫЙ АНТИГЕН ВОВВЕТЕЬЬА РЕЙТО 8818(57) Изобретение относится к медицинской промышленности и может быть использовано при получении коклюшнойвакцины. Цель изобретения - интенсификация способа. Для полученияфракции НА Воп 1 ее 11 а регйпввдв культуру в одной фазе выращивают в жидкой питательной среде известного состава, в которую дополнительно вводятметилированный 4- или р-циклодекстринв концентрации 1-10 г/л. При необхо"димости дня стимуляции роста в средувводят 0,1-20 г/л казаминокислот,0,01-1 г/л аскорбиновой кислоты и0,1-5 г/л глютатиона. Процесс культивирования ведут при 20-37 С в условиях аэрации и перемешивания, обеспечивающих концентрацию кислорода1,0-5,5 ррш и пеногашение. Отборкультуральной щдкости для выделенияцелевого продукта осуществляют настадии от -логарифмической фазы ростадо статической, 4 табл.Изобретение относится к медицинской промьппленности и может быть использовано при получении коклюшнойвакцины,5Цель изобретения - интенсификацияспособа.П р и м е р 1. В ферментер объемом 50 л загружают 35 л модиФицированной питательной среды, 1 Осодержащей глутамат натрия10,72 г/л, 1-пролин 0,240 г/л,Фосфат калия 0,5 г/л, хлорид калия0,2 г/л, хлорид магния 0,1 г/л,хлорид кальция 0,02 г/л, трисгидроксиметиламинометан 6,1 г/л, казаминокислоты 10,0 г/л, рН 7,3 (основная среда). Стерилизуют при 121 С6в течение 30 мин.20Отдельно готовят дополнительную жидкость, содержащую 1-цистеин гидрохлорид 0,04 г/л, сульфат железа 0,01 г/л, аскорбиновую кислоту / 0,4 г/л, ниацин 0,004 г/л, глютатион (восстановленный тип) 0,15 г/л Эту среду стерилизуют с помощью мембранной фильтрации, Основную и дополнительную среды смешивают перед использованием. Стерильный метилированный -циклодекстрин добавляют в конечной концентрации 1,0 г/л.После инокулирования В,рег 1 оявя 1 фазы в количестве 1 10 микр.тел среду культивируют при аэрации через дно реактора с помощью барботера с механичсским обеспечиванием при 35 С, рН 7,2, в течение 24 ч при различном количестве растворенногокислорода (ДО).Повышенный рост микроорганизмов и интенсивное продуцирование Фракции НА наблюдается в диапазоне до 0,7-6,0 ррш, особенно при 1,0-5,5 ррш.К культуральной жидкости или к жидкой фазе культуральной жидкости добавляют сульфат аммония до степени 1/3 насьпцения. Осадок отделяют центрифугированием или Фильтрованием. Осадок растворяют в фосфатном буфере (рН 7,2), содержащем 1 моль БаС 1, К50 раствору добавляют сульфат аммония до степени 1/2 насьпцения, осадок отделяют центрифугированием или Фильтрованием, диализуют против фосфатного буфера. Полученный раствор ультрацентрифугируют, верхний слой жидкости центрифугируют в градиенте плотности сахаровы и отделяют верхний слой жидкости (фракции НА В,регСцввв). Выделение осуществляют предпочтительно при 4 С и ниже. Полуоченная фракция НА содержит большое количество ЕРР-НА и Р-НА.Фракцию НА разбавляют солевьпч раствором до 2-3-кратного разбавления и добавляют Формалин в концентрации от 0,1 до 1,2 об,7, Смесь обрабатывают при 20-43 С в течение 3-60 дней,. ЬРР активность и активность НБР (гистамин-чувствительный Фактор) уменьшаются и получают нетоксичную ФракциювВ сравнительных примерах 1-10 и примерах 2-5 проводят сравнение по.лучения Фракции НА В,реггцяя 1 я в различных условиях культивирования (при постоянной аэрации и скорости перемешивания и при переменной аэрации и перемешивании).В ферментер емкостью 14 л загружс - ют 10 л среды (по примеру 1) и инокулируют культуру в количестве10микр.тел/мл. Культивируют при аэрации и перемешивании при 35 С в течение 36 ч.Влияние условий аэрации и перемешивания на интенсивность роста культуры В.регйцяяьв 1 фазы и выход целевого продукта представлены в табл.1.В сравнительных примерах 1-5,7 и 8 культивирование осуществляют при постоянных аэрации и перемешивании беэ пеногашения и в этом ряду примеров условия культивирования в сравнительном примере 5 (скорость перемешивания 100 об/мнн, аэрация - 0,5 УУМ) приводят к хорошему продуцированию фракции НА. Однако скорость роста быстро уменьшается и после Зб ч культивирования концентрация клеток не превышает 15.Оз микр.тел/мл,В сравнительных примерах 7 и 8 культивирование. осуществляют при постоянной скорости перемешивания 500 или 600 об/мин при скорости аэрации 0,2 77 М без пеногашения. После 5-10 ч выращивания клетки либо прилипают к верхней стенке реактора, либо культура выбрасывается из реактора за счет сильного пенообразования, продуцирование НА-фракции низкоеВ сравнительном примере 10 культивирование осуществляют при контролировании ДО, но без пеногашения.В этом случае также продуцированиеНА-фракции очень низкое из-за адгезии клеток и их выброса с пеНой.В сравнительных примерах 6-9 культивирование осуществляют при постоянной скорости аэрации и перемешиваниис пеногашением. Во всех случаях, вкоторых количество ДО на начальнойстадии культивирования больше 6,0 ррш,условия, пригодные для продуцирования фракции НА, не обеспечивались.С интенсификацией роста культура ДОуменьшается и через 36 ч его уровеньснижается до 0,7 ррш, что неблагоприятно влияет на размножение клетоки продуцирование фракции НА.В сравнительном примере 9, гдеосуществляют пеногашение с помощьюхимических веществ, через 36 ч концентрация клеток достигает80 10микр.тел/мл, но количестваГ-На и ЬРР-НА составляет 128 НА/мли 500 ЬРЕ ед,/мл соответственно.В примерах 2-5 культивированиеосуществляют при контролировании ДОв диапазоне 1,6-3,5 ррш с помощьюавтоматического и непрерывного контроля аэрации и скорости перемешивания ДО-контролером. После 10 ч микроорганизмы росли в логарифмическойфазе и после 36 ч получены высокиеурожаи клеток Р-НА и ЬРГ-НА,Осуществление аэрации с поверхности препятствует продуцированиюфракции НА.В сравнительном примере 11 ипримерах 6 и 7 проводят сравнительное культивирование по предлагаемомуспособу и в стандартных статическихусловиях. Количество инокулята1 10 микр.тел/мл, температура 35 С.Статическое культивирование (сравнительный пример 11), Реактор длякультивирования 1,5 л, колба КОИХ;среда - модифицированная (пример 1)в количестве 0,2 л, время инкубирования 120 ч.Культивирование под контролем(пример 7), ДО-контроль 2,2-2,4 ррах.Пеногашение механическое с помощью 472664вращающегося диска. рН-контроль:рН 7,3, время инкубирования 35 ч.Сравнительные данные по культивиБрованию в различных условиях приведены в табл.2Из табл.2 следует, что способпо.изобретению в 2-3 раза эффективнее статического культивирования по10 концентрации клеток, в 10 и болеераз - по уровнюРР-НА, время инкубации сокращается до 35 ч,П р и м е р 8. Фракцию НА,полученную в примере 1, разбавляют1 Б физиологическим раствором до уровняконцентрации протеина 30 мкгТСАРИ/мл. К раствору добавляют формалин в концентрации 0,6 или1,0 об.7. и смесь обрабатывают при 37о20 или 39 С в течение 5-21 дня, на ста"дии обработки формалином добавляютаминокислоты (глицин, лизин, серии,метионин, цистеин, глютамат натрияили аспарагиновая кислота в концентрации 0,25 М или смесь глицирина и серина в концентрации 0,15 М).В течение обработки формалиномаггрегируется осадок, а раствор диализуют для удаления формалина. ЦеЗО левой продукт контролируют на остаточную токсичность на мышах, а. после трехнедельного хранения при 37 С- на обратимую токсичность.П р и м е р 9. Штамм Томаша фазы 1 В.реггцззз культивируют в сре"де Вогйе 1-реп-деп 8 оп, получают посевную культуру и используют ее дляинокулирования 0,4 л модифицированной среды (пример 1) которая до 40 полнительно содержит 10 мг/мл метилированного 4-циклодекстрина, вдвухлитровой колбе при конечной концентрации 10 микр.тел/мл.3Инкубацию осуществляют при вра 4 Б щательном встряхивании при 200 об/мини при 35 С в течение 18 ч для получения посевной культуры.Полученные культуры объединяюти инокулируют в такую же среду, какБО было описано, в ферментер емкостью300 л в количестве 1 10 микр.тел/мл;культивируют в условиях аэрации иперемешивания.Культивирование осуществляютББ при автоматическом контроле аэрациии скорости перемешивания, поддерживая ДО в диапазоне 1,8-2,7 ррш, Температуру поддерживают на уровне35 С, рН 7,2. Пеногашение осуществ 5 14472(:.С 6лякп механически с помощью ротацион,2 мг/мл (в расчете на алюминий),ного диска. при зтом НА-фракция адсорбируетсяЧерез 35 ч культивирования отби- на геле, к которому добавляютрают пробу культуральной жидкости и 5 0,01 вес./об. , тимерсола. Получаютизмеряют концентрацию клеток очищенную убитую адсорбированную(1024 НА/мл) и ЬРГ-НА (2400 ЬРЕ ед/мл) Результаты проверки вакцины пред-.Культуральную жидкость центрифугиру- ставлены в табл.3.ют и отделяют супернатант. К нему 10 П р и .м е Р 10, К разбавленномудобавляют сульфат аммония до степени раствору нетоксичной фракции НАнасыщения 1/3, образующийся осадок (пример 9) добавляют дифтерийный токотделяют центрифугированием при соид (33 ЬГ/мл) и стол лнячный ток 10000 об/мин в течение 30 мин. Осадок соид (5 ЬГ/мл), к смеси добавляютрастворяют в буферном растворе 15 гель гидроокиси алюминия (0,2 мг/мл(РН 7,2), содержащем дополнительно в расчете на алюминий) для получения1 моль ИаС 1, и отделяют нерастворен- адсорбированной тривакцины. К смесиные вещества центрифугированием при добавляют 0,02 вес./об. . желатияы и10000 об/мин в течение 30 мин, К по-О, 1 вес./об.глюкозы для стабилизалученному верхнему слою жидкости до ции препарата, а также 0,01 вес,/об. ,бавляют сульфат аммония до степени тимерсала в качестве фиксатора.насыщения 1/2, Получающиеся осадки Свойства полученной тривакциныотделяют центрифугированием по опи- представлены в табл.4.санной методике и повторно растьоряют в буферном растворе, диализуют25Таким образом, использование предпри 4 С и нерастворенные вещества лагаемого способа позволяет интенсиотделяют центрифугированпем и отбраФицировать процесс получения коклюшсывают, Раствор усиленно центрифуного антигена, используемого длягируют, супернатант центрифугируют приготовления моно- и тривакциныв градиенте плотности сахарозы (АКДС-вакцины),10-30(39000 об/мин в течение20 мин) и затем отделяют Фракции НА. ф о р м у л а и з о б р е - е н и яПолученные Фракции НА обьединяют истерилизуют фильтрованием через мем- Способ получения фракции НА собранный фильтр. РаствоГ, содержащий 35 держащей защитный антиген Вотщее 11 аНА-фракцию, разбавляют буферным Раст- регзз.з, включающий культивировавором до концентрации протеина ние штамма Вогс 1 еСе 11 а регза.з в300 мкг ТСАР/мл. Все стадии обработ фазе в жидкой среде в присутствиики культуральной жидкости и очистки 1-10 г/л метилированного Ы-циклоцелевого продукта осуществляют при "О декстрина или метилированного Р -цик 2-4 С.лодекстрина и при необходимости 0,1 К полученной НА фракции добавля г/л казаминокислот, 0,01-1 г/ласкорбиновой кислоты и 0,1-5 г/л-80 0 02 вес./об,желатины и глютатиона в.условиях перемешиваниятвина- , , вес. оол ченной НА0,25 М глицина и хранят смесь в те- . при 20-37 С и отбор полученноичение 7 дней при , месь по л7 " 39 С С е после фракции из культуральной среды наф сфатного стадии от логарифмической фазы ростахранения диализуют против фос.атногоб фуфера р Н 7 2 дополнительно содер- до статической фазы роста, о т л ижащего 0,7 вес./об. . ИаС 1, и полу- ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюбу О интенсификации способа, культивироченный раствор разбавляют тем же увание и оводят в присутствии раствсренного кислорода в количестве 1,05 5 ш в условиях, обеспечивающихнетоксичной НА-фракции добавляют гельРРисключение пенообразование.гидроокиси алюминия в количестве1447266 Т а б л и ц а 1 Условия Пример АэрацияЧЧ, И ПеремешиКонтроль 00, ррщ ф Полученное количество после 36 ч култивироОбеспекультивировани вание, об/мин нива 4 Ф ниеНА/мл ЬРЕед/мл 10 микр.тел/мл Сравнительный1 0,05 50 0,10 100 0,50 50 0,50 300 0,50 100 0,50 100 0,20 500 0,20 600 0,20 600 0 0 8 4 0 1 4 0 15 16 100 Постоян ные аэрация и пе 30 128 90 ремешивание 7 30 16 50 10 4 0 80 128 500 30 16 50 Авт +(2,5-3,5) Автф+ ф 10 Предлагаемый2 Авт 100 +(24-28) 120 512 1100 100 512 1000 120 512 1100 120 1024 1300 Непрерывное ва 0,50 Авт (1,6-3,2) рьирование аэрации и пе+(2,3-2,.6) Авт Авт Авт Авт +(1,7-1 ь 9) ремешивания При контролировании (+), без контролирования (-).С химическим обеспениваюшим агентом (+), механическое обеспенивание (-)."Авт" означает, что аэрацию и перемешивание изменяют автоматическидля контроля )О,СтатичесПоказателикультивирования кое культивирование прототип) Пример 6 Сравнительныйпример 11 Пример 7 Да КонцентрацияклетокРезультат Содержание азота протеина,мкг/мл 8 Тест яа стерильность Тест на устойчивость Концентрация ионов водорода Тест на независимостьот термолабильноготоксина Прошел Тест на токсичность(по уменьшению живоговеса мьппи), ВЧП ед/мл Добавление метилированного Ыили р-циклодекстрина КоличествоЫ РЕ-НА,1447266 Продолжение табл. 3 Тест на токсичность(по чувствительностик гистамину мыши),НЯ ед/мл Пирогенный тест (общая температура 2 С) Прошел,0,4 Содержание алюминия,мкг/млСодержание тимерсала,вес./об.7. О, 168 0,009 Содержание формальдегида, вес./об,7 0,002 Тест на независимость от аномальной токсичности.,Прошел на мыши на гвинейскойсвинье Тест на эффективность, Прошел,1 Р ед/мл 13,5 Т а блица 4 Характеристика тривак- Результатцины Содержание азота протеина, мкг/мл 28,0 Стерильно Тест на стерильность Прошел Тест на устойчивость 6,72 Тест на независимость от термолабильноготоксина Прошел Прошел 9,3Тест на токсичность(по уменьшению Концентрация ионовводорода Прошел0,82(4, 2-17,0 Тест на токсичность(по увеличению лейкоцитов мьппи),ЬР ед/мл Тест на токсичность(общая температура2 С) ошел,0,5 7 одержание тимер=ала, вес./об.7 Ов 0094 держание формальгидавес,/об.7 0,0 Тест на независимость от аномальнойтоксичности: Проше а гвинейсвинье ест на стерильность: на кроли а гвинейской свинь Тес ед/ вность. аэ ек Прошел,13 Проше 48, дифтерийныитоксоид столбнячный ошел 44,2 оксо Содержание алюния, мкг/мл мл екоклюшнавакцина Прошел 0,66