Способ изготовления индикаторных полос для определения глюкозы в крови

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ЯО 126902 м 4 0 01 асг14 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ЕЛЬСТВУ К АВТОРСКОМУ С ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНДИКАТОР-НЫХ ПОЛОС ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ В КРОВИ(57) Изобретение относится к медицине, а именно к способам изготовления индикаторных полос для определения глюкозы в крови. Цель изобретения - упрощение способа и повышение качества индикаторного слоя полос. ,Форфатцеллюлозную бумагу пропитывают 1 Б-ным раствором омяленного сополимера винилхлорида с винилацетатом в ацетоне и высушивают. Полученную бумагу пропитывают раствором о-толи- дина в этаноле и сушат. На полученную бумагу наносят смесь, содержащую ферменты, поливинилацетат и буфер, После высушивания полученную индикаторную бумагу наклеивают на полимерную основу и нарезают. 3 з.п. ф-лы, 9 табл.69021 1 12 Изобретение относится к медицине,а именно к способам изготовления ин дикаторных полос для количественного определения глюкозы в крови.Цель изобретения - упрощение способа и повьппение качества индикаторного слоя полосЦель достигается тем, что вместо желатины используется один или несколько синтетических полимеров в виде растворов или дисперсий, при изготовлении индикаторных полос не требуется термостатирования наносимого состава, сушка индикаторной полосы занимает 1,5-2 ч.Способ осуществляют следующим образом.Наносят на полимерную подложку индикаторного слоя, включающего впитывающую целлюлозную основу (в том числе модифицированну 1 о катионообменную целлюлозу), глюкозооксидазу, пероксидазу, хромогенный реагент о-толидин, с последующей сушкой слоя ипи отверждением и нарезкой. Приэтом вместо желатины используют один или несколько синтетических или искусственных полимеров в виде растворов иди дисперсийП р и м е р 1, Бумагу карбоксиметилцеллюлозную пропитывают 1%-ным раствором 0-толидина в этиловом спирте и высушивают при комнатной температуре 20-30 мин. Готовят смесь следующего состава:Вода 55 млГлюкозооксидаза изРемсШцш чзЛа 3.еРЫорХ. е 1 ВХа 0,16 гПероксидаза 0,04 гФосфатный буфер 2 И(рН 5,5) 4,8 мл Смесь при комнатной температуре перемешивают с помощью стеклянной палочки кпи магнитной мешалки в течение 5-7 мин, В результате должен получиться гомогенный раствор желтовато-коричневого оттенка, которыйга характеризуется плотностью 17 =1,015 г/см и вязкостью " =1,02 сП. Наносят смеоь на карбоксиметнлцеллюлозйую бумагу, предВарительно обработанную раствором о-толидина. После высушивания при комнатной температуре в течение 40-60 мин полоса пропитывается в 0,3%-ном растворе триацетатцеллюлозы в диоксане при соотношении пропиточного раствора кбумаге 0,7-1,0 г на 100 см0,3%-ный раствор триацетатцеллвлозы в диоксане готовят при комнат ной температуре растворением 0,9 гмелко нарезанной триацетатцеллвлозной пленки в 300 см диоксана, пред 3варительно перегнанного над металлическим натрием, Получаемый раствор70 10 характеризуется плотностьв=1,035 г/см и вязкостью=2,102 сП.Полученную индикаторнув бумагувысушивают в течение 20 мин при комнатной температуре, наклеивают на 15 полимерную основу с помощью двухсторонней липкой ленты и разрезают на полосы необходимых размеров, . Индикаторная зона полученных полос в исходном состоянии имеет белыйцвет с кремовым оттенком. Коэффициент отражения полос в области600 нм равен 61-63%. После контакта в течение 1 мик с кровью, содержащей глюкозу, и последующего смывания крови водой индикаторный слойприобретает голубую окраску. Приконцентрации глюкозы в крови5,5 ммоль/л коэффициент отраженияполос 44%. При концентрации глюкозыв крови 11,2 ммоль/л коэффициентотражения полос 37%. Окраска устанавливается сразу после смыванияпробы и сохраняется в течение по З 5 крайней мере 20 мин,П р и м е р 2. Хроматографическув бумагу, содержащую карбоксильные или фосфатные группы, пропитывают 2%-ным раствором триацетатцеллвлозы в смешанном растворителе аце"тон - диоксан при расходе пропитыгвающего раствора 1, 0-1, 5 г на 1 00 смбумаги.452%-ный раствор триацетатцеллвлозыготовят растворением при комнатнойтемпературе 6 г мелко нарезанной3триацетатцеллвлозной пленки в 300 смсмеси диоксана с ацетоном, взятых вобъемном соотношении 1:1 (диоксан 50предварительно перегоняется над металлическим натрием). Получаемый раствор характеризуется плотностьвго 3 7 а84 мл Интенсивность окраски полос устанавливается в течениемин и не меняется по крайней мере в течение30 мин ф П р и м е р 3. 50 г порошковойкарбоксиметилцеллюлозы обрабатывают150 мл 1%-ного растворами -толидинав этиловом спирте, перемешивая дополного удаления растворителя. Пропитку порошковой карооксиметилцеллюлозы этанольным раствором О-толидина проводят под вытяжкой при комнатной температуре путем перемешивания стеклянной палочкой смеси карбоксиметилцеллюлозы с раствором О -толидина до полной ее однородности. Перемешивание (под вытяжкой) продоло жают на водяной бане при 50 С в широкой фарфоровой чашке в течение 20- 30 мин до получения сухого однородного порошка кремового цвета. ВодаГлюкозооксидаза изРепсШллп чх 1 а 1 еРЫор 1. еС В 3.1 а . 3,4 гПероксидаза 0,1 гФосфатный буфер 2 М(50%-ная водная дисперсия) 19 гд-толидин (1%-ныйраствор в этаноле) 58 млСмесь, содержащую указанные компоненты, перемешивают с помощью стеклянной палочки или магнитной мешалки при комнатной температуре в течение 5-7 мин. Получаемая смесь должна представлять собой однородную эмульсию кремового цвета, котораяго характеризуется плотностью=0,9846 г/см г и вязкостьюг =5,25 сП.Смесь наносят в количестве 3,0- 3,5 г на 100 см бумаги. После высуго шивания в течение 15-20 мин при 50 С получается индикаторная лента кремового цвета, которую наклеивают на подложку с помощью двусторонней липкой ленты и нарезают на полосы. После контакта с кровью в течение 1 мин и смывания крови водой полосы окрашиваются в голубой цвет. Зависимость интенсивности окраски от концентрации глюкозы в крови (коэффициент отражения Т при) 600 нм) показана в табл. 10,4 г 0,1 г Результаты испытаний приведеныв табл, 2,Получается носитель с хромагеннымреагентом. Готовят смесь следующегосостава:Вода 50 мл5 Глюкозооксидаза изРеп с 111 пп ч 1 а 1 еРйор 1 е 1 В 1 а.Пероксидаз аФосфатный буфер 2 М0 (рн 5,5) 12 млПоливинилацетат(50% водная дисперсия) 50 гНоситель с хромогеннымреагентом 20 г15 Смесь, содержащую укаэанные компоненты, перемешивают стеклянной палочкой или магнитной мешалкой прикомнатной температуре в течение 1 О 5 мин, В результате должна полу читься однородная паста кремовогоцвета, характеризуемая плотностьюгог=1,173 г/см и вязкостью=20 П.Полученную пасту при комнатной температуре наносят через фильеру или 25 с помощью кисти - на активированную .полимерную подложку.Смесь тщательно перемешивают инаносят на активированную полимернуюподложку в количестве 6-7 г на 100 см3 30 подложки, сушат при комнатной температуре в течение 1,5-2 ч и нарезают на полосы,Активированную полимерную подложку получают путем погружения триацетатцеллюлозной пленки в ванну с 30%ным раствором щелочи (гидроокисинатрия) при 50 С на 10 мин, Послещелочной обработки пленку промываютводопроводной водой в течение 10 мин.40 при 15-20 С до нейтральной реакциипромывной воды, а затем прополаскивают в течение 2-3 мин в дистиллированной воде. Промытую активированнуюполимерную подложку сушат при ком.натной температуре 30-40 мин. Полученная пленка отличается от обычнойисходной триацетатцеллюлозной подложки слабым матовым налетом.Индикаторная зона полос в исход ном состоянии имеет кремовую окраску. При контакте с кровью в течение1 мин и последующем смывании кровиводой полосы приобретают голубойцвет, интенсивность которого возрастает с ростом концентрации глюкозы вкрови12690Интенсивность окраски полос устанавливается спустя 1 мин после смывания крови и сохраняется постоянной по крайней мере в течение 30 мин.П р и м е р 4, фосфатцеллюлознуюбумагу пропитывают 1%-ным растворомэтилцеллюлозы.1%-ный раствором этилцеллюлозыполучают растворением 2 г порошковойэтилцеллюлозы в 200 см смеси толуо Ола и этанола, взятых в объемном соотношении 1:1, Раствор характеризуется=0,832 г/см ,=0,893 сП.Этим раствором пропитывают фосфатцеллюлоэную бумагу при соотношении 151,5-2,0 г указанного раствора на7 о100 см бумаги. Высушивают при 50 Св течение 10 мин,Полученную бумагу пропитывают 1% -ным раствором 6:-толидина в этаноле 20при соотношении 0,7-1,0 г растворана 100 см 7 бумаги, высушивают при 30 С втечение 15 мин.На полученную бумагу наносят смесь следующего состава.Вода 60 мп25Глюкоэооксидаза изРеп 1 сШ 3.ап чЫа 3.е,РЫор 1. е 1 Входа 0,2 гПероксидаза 0,05 гфосфатный буфер 2 М(50% водная дисперсия) 22 гоСмесь, содержащую указанные компоненты, при комнатной температуреперемешивают стеклянной палочкой илис помощью магнитной. мешалки в течение 5"7 мии. В результате должна по"лучиться однородная эмульсия кремового цвета, которая характеризуетсяплотностью=1,038 г/см и вязкор3стью=2,957 сП.Соотношение смеси к бумаге 1 0 гУ1,5 г на 100 см . После сушки в течение 40 мин при комнатной темпера- ф 5туре получают индикаторную бумагукремового цвета, которую наклеиваютс помощью двусторонней липкой лентына полимерную .подложку и нарезаютна отдельные полосы. При контактес кровью в течение 1 мин и последующем смыванхи крови водой коэффициент отражения полученных полос приЬ)600 нм изменяется в зависимостиот концентрации глюкозы в крови, 55Зависимость коэффициента отражения полос от концентрации глюкозыв крови дана в табл. 3.Окраска устанавливается через1-2 мин после смывания пробы кровии сохраняется постоянной по крайнейиере в течение 30 мин.П р и м е р 6. Хроматографическую бумагу, содержащую карбоксильныеили фосфатные группы, пропитывают2%-ным раствором уретанового каучукав этилацетате при соотношении 1 07У1,5 г раствора на 100 см бумаги,высушивают при комнатной температуре в течение 30 мин,2%-ный раствор каучука готовятрастворением при комнатной температуре 4 г мелко нарезанного каучукав 200 см этилацетата. Получаемый3раствор характеризуется плотностью7 о 70=0,772 сП.На полученную бумагу наносят смесьследующего состава:Вода 84 млГлюкозооксидаза изРепс 1 Ххпш чСа 3.еРЫорХ. е 1 В 1 ыПероксидаза 0,4 г 0,1 г 21 ЬП р и м е р 5, Фосфатцеллюлозную бумагу пропитывают 1%-ным раствором омыленного сополимера винилхлорида с винилацетатом А-0 в ацетоне присоотношении 1,5-2,0 г раствора на 100 см бумаги, высушивают в тече 7ние 10 мин при. 50 С.1%-ный раствор омыленного сополимера винилхлорида с винилацетатом А-0 готовят растворением при комнатной температуре 2 г сополимера в 200 см ацетона, Полученный раст 320 вор характеризуется плотностью=0,7895 г/см и вязкостью у=0,547 СП.Полученную бумагу пропитывают %- ным раствором о "толидина в этаноле при соотношении 0,7-1,0 г раствора на 100 см бумаги, сушат при 50 С в течение 10 мин. На полученную бумагу, наносят смесь, содержащую ферменты, поливинилацетат и буфер, как в примере 4. После высушивания при 50 С в течение 20 мин полученную индикаторную бумагу наклеивают на полимерную основу и нарезают. Аналитические характеристики получаемых таким образом полос выражаются следующей зависимостью коэффициента отражения полос от концентрации глюкозы в крови, которая представлена в табл. 4.(503-ная водная дисперсия)5 тО -толидин ( 1 Х - ныйраствор в этаноле) 58 млнСмесь готовят как в примере 2.При контакте полос с кровью в течение 1 мин и последующем смывании О крови коэффициент отражения полос в областиЯ 600 нм зависящий от кон- б , центрации глюкозы в крови, представ- н лен в табл. 5. 19 г 0,2 г0,05 г Интенсивность окраски полос не меняется по крайней мере в течение 30 мин после смывания пробы.П р и м е р 7. Бумагу карбоксиметилцеллюлозную пропитывают 2 -ным раствором нитрильного каучука в метилэтилкетоне при соотношении 1-0- 1,5 г раствора на 100 см бумаги, высушивают при комнатной температу ре в течение 30 мин.Для приготовления 2 Е-ного раствора каучука 4 г мелко нарезанного каучука растворяют при комнатной температуре в 200 см метилэтилкетона. Получаемый раствор характериэугоется плотностью 1" =0,806 г/см и вязкостью=0,718 сП.Затем пропитывают 1 -ным раствором 0 -толидина в этаноле при соотношении: 0,7-1,0 г раствора на 100 см бумаги, сушат при комнатной температуре 20-30 мин.На полученную бумагу наносят смесь следующего состава:Вода 60 млГлюкозооксидаза изРепсШцш чСа 3.еРЫор 1. е 1 ВПаПероксидазафосфатный буфер 2 И(50 ,-ная воднаядисперсия) 22 гСмесь готовят как в примере 4.Наносимый состав и пропитываемую бумагу берут в соотношении: 0,8-1,2 г смеси на 100 см бумаги. После сушкигпри комнатной температуре в течение 1,5-2 ч индикаторную бумагу кремового цвета наклеивают на.подложку и нарезают как и в предыдущих примерах,При контакте с кровью в течение 1 мин и последующем смывании водой олубая окраска полос (Т при Ь 600 нм)ависит от концентрации глюкозы врови следующим образом.Результаты испытаний даны вабл. 6.Окраска полос стабильна в течеие 20-30 мин.П р и м е р 8. Бумагу карбоксиетилцеллюпозную пропитывают 1 -нымаствором б-толидина при соотношении 1,0-1,5 г раствора на 100 смумаги, высушивают при 300 С в течеоие 15 мин, после чего на нее наносят смесь следующего состава:15 Вода 55 млГлюкозооксидаза изРелхс 11 цн ч 1 а 11 еРЫор 1. е 1 В 11 ах 0,16 гПероксидаэа 0,04 гфосфатный буфер 2 М(рН 5,5) 4,8 млСмесь готовят как в примере 1.Смесь наносят при соотношении1,0-1,5 г на 100 см бумаги. После 25сушки при 50 С в течение 20 мин поолученную бумагу пропитывают 0,1 - ным раствором ацетобутиратцеллюлоэыв этилацетате при соотношении 0 8 гФ1,2 г раствора на 1 ОО см бумаги. З 0 1 Е-ный раствор ацетобутиратцеллюлозы готовят растворением при комнатной температуре 0 2 г поронкообЭразного полимера в 200 см этилацетата. Получаемый раствор характери зуется плотностью о =0,891 г/сми вязкостью 2 =0,668 сП.Индикаторную бумагу сушат приФкомнатной температуре в течение20 мин, наклеивают на подложку и на резают на полосы.При контакте с кровью в течение1 мин и последующем смывании кровиводой интенсивность окраски полос(Т при 3 600 нм) зависит от концент 45 рации глюкозы.Результаты испытаний даны втабл. 7Окраска полос сохраняется постоянной в течение 20-30 мин.50 Сравнительная характеристикапредлагаемого способа изготовленияиндикаторных полос для определенияглюкозы в крови и известного приведены в табл. 8.55 Зависимость коэффициента отраженияиндикаторных полос от времени, прошедшего после смывания крови,12690211 Освязывающего компонента в индикаторный слой вводят один или несколькосинтетических и (или) искусственныхполимеров, при этом используют раст 5 воры полимеров в органических раст- .ворителях.2. Способ по п. 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что в качествесинтетических полимеров используютполивинилацетат, нитрильный каучук,уретановый каучук, омыленный сополимер винилхлорида с винилацетатом. формула изобретения 1. Спо соб из го товления индикаторных полос для определения глюкозы в крови, включающий нанесение на полимернуюподложку индикаторного слоя, в состав которого входят целлюлоэная основа, выполненная в виде бумажной ленты либо в виде порошка, глюкозооксидаза из РепсШюв чИа 1 е РЫорХ е 1 В 1 а, пероксидаза, хромогенный реагент о-толидин, буер и связывающий компонент с последующим высушиванием слоя или его отверждением и нарезкой, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и повышения качества индикаторного слоя полос, в качестве Таблица 1 ммоль/л 0 4,4 9 5 3,3 21,6 ТХ 69 44 32 27 21 Таблица 2 С гвомзыммоль/л 0 2,8 6,7 15.,0 22,8 Ту Х63 52 41 30 23 Таблица 3 Показатели Проба Цельная кровьС р,ммоль/л 2,8 5,0 7,8 11,7 16, 23,3 63 58 52 47 4 Т, Я,36 Т=707 Сухая полоса Полоса, смоченнаяводой Т=69 Х 9показана в табл. 9,(время контакта с кровью 60 с., С=154 мг 7.). 3. Способ по пп. 1 и 2, о т л ич а ю щ и й с я тем, что используютдисперсию поливинилацетата в воде,4. Способ по и. 1, о т л и ч а -ю щ и й с я тем, что в качестве искусственных полимеров используют 2 б триацетатцеллюлоэу, этилцеллюлозу,ацетобутиратцеллюлоэу.1269021 12 Таблица 4 Проба Показатели Цельная кровь 41 36 50 61 Т, 7. Т=717. Сухая полоса Полоса, смоченнаяводой Т=68 Е Таблица 5 Показатели Проба 47 38 27 9 Т=68 Х Т=69 Х Таблица 6 О 6 1 0)5 15 5 20 О 22268 48 41 37 33 31. Т,Таблица 7 С глюкозы эммоль/л 0 5,0 10,0 13 9 21,0 70 58 51 о 46 40 Т, Е ФЦельная кровьС р ры ммоль/л Т, ХСухая полоса Полоса, смоченнаяводой Сгвюкозы ммоль/л Зу 9 8,3 14,5 21,З,З 6,1 128 189 23,314 1269021 13 Таблица 8 Показатели по способу УсЛовия процесса известному . предлагаемому 4-6 1,5-2,0 Температура наносимого.состава, Со 10-60 40-45 Т а б л и ц а 9 Коэффициент отражения, 7, после смывания крови, мин Способ 0 Оф 5 1 1 ю 5 2 2 ф 5 44 43 43 43 43 43 49 46 44 43 42 42 Составитель М. ПознякРедактор О. Головач Техред ЛСердюкова Корректор М, Демчик Заказ 6028/46 Тираж 778 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, 3-35Раушская наб д. 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Время сушки бумажнойленты после нанесенияиндикаторного состава, ч Необходимость в термостатироваиии при нанесении индикаторногосостава ПредлагаемыйИзвестный Обязательно, поскольку вязкостьнаносимого составазависит от температуры Не надо, вязкость наносимого состава практически не зависит от темпе- ратуры