Способ получения пептидов или их солей

) 05. 12. 74 оеуаарствениый комит СССР ио делам изобретени и открытий3) и УДК 547. 964, .407(088.8) юллетень 33 убликовано 07,09,82. 5 ата опубликовании описа я 07.09. ИностранцыЛейф Эрик Аурелл и Карл Геран(ШвЕция) 71 Заявител 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ ИЛИ И бу ги ее т Из обретение от носится к спосо получения пептидов - новых биоло чески активных соединений, которы могут найти применение в биохимии и медицине.В химии пептидов широко используют метод постепенного наращивания пептидной цепи за счет конденсации активированных аминокислот, например, способам активированных эфиров 1;Цель изобретения - синтез новых пептидов, содержащих хромогенную группу, которые обладают интересными свойствами.Поставленная цель достигается т м, что согласно способу получения пеп идов общей формулыК- Л- А,1- Гли - Арг - ИН, где Й - водород, бензоил;Е - и-нитроанилид)А - аспарагинил, глицил, изолейцил, лейцил, валил, пролил, тирозил, фенилаланил;А - глютаминовая кислота, глютамин, аспарагиновая кислота, или их солей, соединение общей Формулы НМ-Й, в которой К имеет указанные значения, подвергают взаимодействию с соответствующей аминокислотой и далее требуемую пептидную структуру постепенно наращивают путем сочетания остальных аминокислот, причем группу К используют в качестве защитной группы для С-концевой карбоксильной группы первой аминокислоты.Для наращивания требуемой пептидной структуры используют сочетания аминокислот методом активированных эфиров.В этом ступенчатом синтезе пептидных производных используют хорошо известные в химии пептидов способы и защитные группы: карбобенэокси (Кбо), пара-метоксикарбобенэокси (МеОКб), пара-нитрокарбобензокси (ИО Кбо), пара-метоксифенилазо-карбобензокси (Икбо), трет-бутилоксикарбонил (БОК), трифторацетил (ТФА) или формил применяют в качестве аминозащитных групп;06-карбоксильную группу активируют путем конверсии в различные производные, которые или могут быть выделены или.получены "1 п з 11 и", напромер, пара-нитрофениловый сложный эфир, трихлорфениловый, пентахлорфениловый, М-гидроксисукцинимидовый, азид и ангидрид кислоты, которые могут быть симметричными.или несимметричными, 9577 б 2Ала-алании, Гли-глицин;Арг-аргинин; Илей-изолейцин;Асп-аспарагин; Лей-лейцин;Аспа-аспарагиновая Мет-метионин;кислота;Глю-глютамйн;.Фе-фе нилалани н;Глю-глютаминовая Про-пролин;кислота;Тир-тирозин; Вал-Валин.Другие сокращения;Ац-ацетил; МкбО-метоксифенилаэокарбобензокси;МеОН-метанол; 60 АцО-уксусныйангидрид; Могут быть активированы также И-карбодиимидом, например, И, И -.дициклогексилкарбодиимидом. Концевая карбоксильная группа в аминопептидном производном или производном аминокислоты может быть защищена путем этерифинации в метиловый,этиловый или изопропиловый эфир или путем превращения в хромофорное анилиновое производное, которое также выполняет функцию защитной группы во время наращи вания пептидной цепи, Те свободныеФункциональные группы, которые непринимают участия в реакции во времясинтеза пептидов или их производных,могут быть защищены следующим образом.Дпя защиты остающейся аргинил---гуанидино-группы используют протонизацию, ИО или пара-толуолсульфонил (ТОС). В качестве защиты карбоксильной группы в глютаминовой кислоте и аспарагиновой кислоте применяют бенэильную и трет-бутильнуюгруппы.Для анализа элюатов и продуктовиспользуют хроматографию в тонкомслое силикагеля 124 (Мерк) .Используют следующие системы растворителей: А при объемном соотношении н-бутанол:уксусная кислота: вода,равном 3:1:1; С при объемном соотноВенин н-пропанол:этилацетат:вода,равном 7:1:2; Д при объемном соотношении п-гептан:н-бутанол:уксуснаякислота, равном 3:2;1; Р при объемном соотношении хлороформ;метанол, 35равном 9:1.После хроматографирования в тонком слое пластинки просматривают вУФ-свете (254 нм) и затем обрыэгива"ют хлор/толуидиновым реагентом. 40Далее применены следующие сокращения.,Аминокислоты.Свободные аминокислоты или пептидуказываются с помощью буквы Н у аминогруппы и ОН у карбоксильной группы.Аминогруппа всегда указывается, слева;карбоксильная группа справа.Все применяющиеся аминокислотыимеют Ь-конфигурацию, если не оговорено дополнительно, АцОН-уксуснаякислота;Бок-трет.бутилоксикарбонил;БзОЛ-бензоил;Бэл-бензил;. ОтБ-трет.бутилокси;ОЭТ-Этилокси Оме-метилокси;ОпНФ-пара-нитрофенокси;Бэ 20"бенэойный ОиэоП-изопропилангидрид; ,окси;КбО-карбобенз- пНА-пара-нитроаниокси; лид;Дцгкди-дициклогек- ТФА-трифторацетилсилкарбодиимид;ЭтЗ И-триэтиламин; ТОС-пара-толуолсульфонил.В примерах, если специально неоговаривается, температура 00 С.П р и м е р 1: НС 1 Бзл-Илей-Глю-Гли-Арг-пПА.1 а.Кбо-Гли-Арг (МО )-пНА (Мол.вес,530,4),Раствор 5,0 г (10,6. ммоль) Кбо-Арг (Ю) -пНА в 21 мл АсОН и22 мл 4 н, НВт в АсОН в безводныхусловиях перемешивают 1 ч при комнат,ной .температуре, затем медленно вливают в 200 мл эфира при энергичномперемешивании. Эфирный раствор отделяют декантацией, а полученный зернистый остаток обрабатывают два разаэфиром по 100 мл. После сушки в вакууме над РО и таблетками КОН при30 С получают бромистоводороднуюсоль аминокислотного производного почти количественно (4,95 г) . Продуктгомогенный согласно тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системе А.Продукт растворяют в. 50 мл перегнанного диметилформамида, растворохлаждают до -10 С и добавляют триэтаноламин до нейтрального значениярН (2,1 мл). Выпавший в осадок бромгидрат триэтаноламина отфильтровывают и фильтрат охлаждают до -10 С.оК раствору добавляют 3,9 г (11,8 ммоль)Кбо-Гли-ОпНФ, смесь медленно нагревают до комнатной температуры, Через3 ч раствор вновь охлаждают до-100 С и вносят 0,54 г (5; 3 ммоль)триэтаноламина. Через 2-3 ч добавляют вновь такое же количество триэтаноламина. Реакционную смесь оставляют на ночь при комнатной температуре,озатем упаривают в вакууме при 40 С.Оставшееся тяжелое масло тщательноперемешивают с 100 мл дистиллированной воды, Воду сливают и промывкуповторяют еще два раза. Оставшеесямасло растворяют.в горячем КОН, поохлаждении продукт осаждается в крис"таллической форме. Выход 4,2 г, продукт гомогенный согласно ТСХ в системе Р , К = 0,1 б,ос 1 = -Зб (с.0,50метайол) .1 Ъ: Бок-Глю- ( О -Обзл) -Гли-Арг (ХОд) .11 а; 2 НС 1 -Илей-Глю-Гли-Лрг-пНА (мол.вес 666,6).100 мг (0,116 ммоль) продукта 1 с обрабатывают с фтористюл водородом и чистят в условиях, описанных в примере 1 а.- Выход 56 мг (73), продукт однороден согласно ТСХ в системе А; Д0,34, о = -35 (с 0,5, 50-ная уксусная кислота в дйтиллированной воде)Анализ на аминокислоты: 0,96 Илей, 0,94 Глв, 0,96 Арг, 1,00 Гли.П р и м е р 111: НС 1 Бэл-Илей-ГлнГли-Лрг-пНА (мол.вес. 733,2).111 а: Кбо-Глн-Гли-Арг (ЫО)-пНА (мол. вес 658,5)2,65 г (5 ммоль) соединения Кбо-Гли-Арг(ИО) пНА.декарбобензоксилируют бромистым водородом в уксусной кислоте и копулируют с 2,2 г (5,5 ммоль) Кбо-Глн-ОпНФ по методу, описанному в примере 1 а. Неочищенный продукт очищают двойной перекристаллизацией из метанола.Выход 2,07 г (63) 111 а. Гомогенность в соответствии с ТСХ в системе А(й = 062), о = -23(с 05 метанол/диметилформамид 9/1). ют с 2,5 г (5,5 ммоль) Бок-Глю( -ОбзлОпНФ.согласно примеру 1 а. Продуктчистят в хроматографической колонкес Сефадексом ЕН в метаноле. Выход3,25 г (91). Продукт гомогенныйсогласно ТСХ в системе Р; (К = 0,22), 563 в = -34 (с 1,0 метанол).1 с: Кбо-Илен-Глю (-Обзл) -Гли-Арг(Ю) -п 1 А. (Мол.вес 862,9) .1,08 г (1,5 ммоль) продукта 1 Ьрастворяют в 10 мл трифторацетата, ОРаствор перемешивают 1 ч при комнатной температуре, затем медленно вливают в 75 мл эфира,при сильном перемешивании. Эфирный раствор декантиру- ют и полученнйй зернистый остаток еще 5 два раза обрабатывают эфиром по 50 мл; После сушки в вакууме над Р О и табо2 летками КОН при 30 С получена трифторуксуснокислая, соль трипептидного проиэведного почти количественно (1,00 г)20Продукт гомогенный согласно ТСХ в:системе Л,Продукт растворяют в 20 мл диметилформамида. Раствор охлаждают до . -10 С и нейтрализуют триэтаноламином(1,68 ммоль) Кбо-Илей-ОпНФ и медленно поднимают температуру раствора до комнатной. Через 3 ч раствор вновь охлаждают до -10 С и добавляют 0,12 млотриэтаноламина. Через 2-3 ч повторно добавляют тризтаноламин и раствор оставляют на ночь. Затем избыток Кбо-Илей-ОпНФразрушают добавлением 100 мг (1,4 ммоль) н-бутиламина к раствору. Через 30 мин раствор упаривают в вакууме при 40 С. Оставшееся тяжепое масло промывают тремя порциями дистиллированной воды, Масло растворяют в МеОН и чистят хроматографией на Сефадексе 2 Нв метано ле. Выход 1,07 г (83). Продукт гомогенный согласно ТСХ в системе Р, й= 0,35,а) д -- -24 (с 0,3 МеОН: диметилформамид 95:5).1 Й: Бзл-Илей-Глю (-Обзл)-Гли- . 45 -Арг (ИО)-йНА.260 мг (0,30 ммоль) продукта 1 с дикарбобенэоксилируют согласно примеру 1 а, Продукт показывает два пятна на ТСХ в системе Л, (й 1 = 0,45 50 и 0,65), и с помощью инфракрасной спектроскопии обнаружено, что продукт является смесью НВг.Н-Илей-Глю(-О) -Гли-Лрг(ИО)-пНА и НВГН-Илей-Глю (-Обзл) -Гли-Арг (ХО ) -пНА.Эта смесь и 800 мг (0,35 ммоль) бензойного ангидрида взаимодействуют в условиях, описанных в примере 1 а. Продукт чистят на Сефадексе ЕНв метаноле. Получают две Фракции:130 мг, к 4 15(с 0,50,р С) 60 й = 0,20 в Р и Я - 105 мгКр ф= -11 (с 0,5, СНСХ) й 1 = 0,06 в РС помощью инфракрасной спектроско.пии обнаружено, что этими двумя фракциями являются Бзл- Илей-Глв(-Обзл)- 65-Гли-Лрг (ХО ) -пНА и Бэл-Илей-Глю-Гли-Лрг(Ю) -пНА.При взаимодействии с фтористым водородом обе фракции дают одинаковый конечный продукт 1 е.1 е:НС 1 Бзл-Илей-Глю-Гли-Лрг-пНА (мол. вес 734).100 мг (0,12 ммоль) К -продукта 1 Й и 0,5 мл анизола помещают в реакционнув колбу аппарата Сакакибара. В колбу отгоняют 5 мл сухого фтористого водорода и оставляют реакционную массу на 75 мин при 0 С. Затем Фтористый водород отгоняют под уменьшенным давлением, маслянистый остаток растворяют в 10 мл уксусной кислоты и чистят хроматографией на Сефадексе дв 33-ной уксусной кислоте (в воде). Затем ФДакцию, содержащую чистое незащищенное тетрапептидное производное, лиофилизувт. Полученное соединение растворяют в смеси метанол:дистиллированная Вода (95 Ф 5) и хроматографируют на слабоосновном анионном обменнике Я АЕ-Сефадекс Лв хлоридной Форме, для элюирования используют ту же смесь растворителей. Метанол удаляют из элвата при 30 С под уменьшенным давлением и оставшийся водный раствор лиофилизируют. Выход 75 мг (85), продукт однороден согласно ТСХ в системе А (й 1 = 0,48), сс и = -40 (с 0,5, 50.-ная уксусная кислота в дистиллированной воде)Лналиэ на аминокислоты: 0,98 Илей, 0,5 Глю, 0,98 Арг, 1,00 Гли.П р и м е р 11: 2 НС 1 Н-Илей-Глю - Гли-Лрг-пНА.111 Ь: Трет-Бок-Илей-Глн-Гли-Арг (ИО )-пНА (мол. вес 737,6).О,бб г (1 ммоль) соединения 111 а декарбобензоксилируют бромистым водородом в АсОН пометоду, описанному в примере 1 а. Полученное соединение 5 растворяют в 10 мл перегнанного диметилформамида, Раствор охлаждают до -10 С и добавляют триэтиламинодо нейтральной реакции. Выпавший в осадок бромгидрат триэтиламина отфиль-О тровывают, фильтрат вновь охлаждают до -10 С Ю к нему добавляют 0,40 г (1,1 мяоль) Бок-Илей-ОпНФ и раствор оставляют медленно нагреваться до комнатной температуры. ЧереЗ 3 ч раст 5 вор вновь охлаждают до -10 С и буфе-о рируют .0,1 мл, (0,7 ммоль) триэтаноламина. Буферирование повторяют через 2-3 ч. Реакционный раствор оставляютдо утра и избыток трет-Бок-Клей"ОпНФ20 приводят во взаимодействие с 0,1 мл (1 ммоль) н-бутиламина. Через 30 мин раствор упаривают в вакууме при 40 С. Оставшееся тяжелое масло тщательно .перемешивают с 100 мл дистиллирован- ной воды. Воду декантируют и промывку проводят еще дважды. Оставшееся масло растворяют в метаноле и очищают в колонке с сефадексом 2 Нв метаноле, используя в качесТве элюирующего средства метанол. Выход 0,56 г (76). Гомогенность по ТСХ в системе А (К = О,бб.).111 се Бзл-Глн-Гли- Агд(ИО ) -пНА мол. вес 741,6).0,56 (0,76 ммоль) продукта 111 Ь 35 растворяют в 5 мл трифторуксусной кислоты. Раствор перемешивают 15 мин при комнатной. температуре, после чего медленно выливают в 100 мл энергично перемешиваемого сухого эфира. Эфиротделяют декантацией и осадок дваждыобрабатывают 50 мл эфира. После сушки в вакууме над РО и таблеткамиКОН при 300 С получают трифторуксусную соль тетрапептидного производногопочти количественно. Продукт гомогенен в соответствии с тонкослойной хроматограммой в системе А.Полученное соединение растворяютв 8 мл диметилформамида, охлаждаютдо -10 С и нейтрализуют триэтанолоамином. Вносят 0,23 г (1 ммоль) бензойного ангидрида и через 30 мин добавляют еще 00 мкл триэтаноламина,Реакционный раствор оставляют до утра и упаривают в вакууме при 40 С.Оставшееся тяжелое масло тщательноперемешивают с дистиллированной водой.Воду декантируют, оставшееся маслорастворяют в метаноле и очищают в колонке, содержащей сефадекс ЕНвметаноле. Выход 0,55 г (95). Гомогенность по ТСХ в системе Ь Яд 0,64).111 Й. Бэл-Илей-Гли-Глн-Лрг-пНА-НС 1,о н н н н и и н Хн ЬО ч 1 ъ Ю 1 Р Э 6 ф о х н х 1 1 1 1 1 1 Х 1 1 О 1 1 611 1 Р 1 1 %ч 1 1 О фч61 Х3 1ОР 1х г -1Ы 1.Е 1 1 Х 16 Ф 1 1 1 1 ч 1 О ОО 1.Х хо ХО Еч 1 1- -с 1Р 1оХ 66 1Я ФЮ111 Х Р 1ОХЕхЯ6 Х 1ч.О йООИ1 ч Р 1ЕХО2 И 1 1оРи оЕ чД.х РЦХЕ 1О ,"3 Ж 1 йееР 1 1 Я Е 11 1 1 1 Р 1 1 Е1 И 1 Х 1 Д 1 1 Р 1-- 1 1 1 61 РФ 4 , с о- Р1й1ХЕ 1, ч оф о о Р 11,Роо ф хЬО 1 .н О 1 ф с Ре 6Э и о о ф х1сЬО1Ю1фсР6ф ЬО Хйч 11 г-Л Осс я1Р ЬОа1 1хЭн 1ф Яч Оо дх о Х ч 1 СРК с ЬО Я ЬО 1 ч) 3с БЬО 61ОИъ ЬОн йЮс 1н;,ф Оснс фсЭч Эооф 1с)ф х116 Чсз сЬОй ЬОч1ни1 Ю1нч Чф 6о фс1фи1 Юоой йо ачо иф ф х х1 1ЬО ЬОй ч1 1Ю Ю1Х Рс с1 1о ойР 6ы хфох 6 Х н - н, н д н .н н Х Х п дх хОх х1г 1с957762 14 13 формула изобретения Составитель В. ВолковаРедактор О. Персиянцева Техред Т.фанта КорректорС. Шекмар Заказ 6634/50 Тираж 445 Подпйсное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, 11 осква, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал,ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 1. Способ получения пептидовобщей формулыК -А-А-Гли - Арг - ЯИ,где Й - водород, бензоил;Й - Н -нитроанилид;А - аспарагинил, глицил, иэолейциллейцил, валил, пролил, тироэил, фенилаланнл;А 1 - глютаминовая кислота, глютамин, аспарагиновая кислота,или их солей, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что соединение общей формулы НИ-К, в которой й имеетуказанные значения, подвергают взаимодействию с соответствующей аминокислотой и далее требуемую пептидную структуру постепенно наращиваютпутем сочетания остальных аминокислот, причем группу Ку используют в5 качестве защитной группы для С - концевой карбоксильной группы первойаминокислоты.2. Способ по п.1, о т л и ч а.ющ и й с я тем, что для наращивания10 требуемой пептидной структуры используют сочетания аминокислот методом активированных эфиров.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Шредер Э., Любке К. Пептиды.Ч. 1, и., фИир", 1967, с. 116,