Способ индентификации штаммов вируса ящура

осксоюЬнля ЗАТЕИ. ХИАС ибл . к:.,БИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Соцналистицеских Республик(45) Дата опубликован С 12 осударстаеииыи комитетСовета 1 лиииотров СССРоо делам иэооретонийи открытий 2 76 Бюллетень7 я описания 24.03.76(72) Авторы изобретен сесоюзный научно-исследовательский яшурный инсти) Заявител 54) СПОСОБ ИДЕИТИФИКАДИИ ШТАММОВ ВИРУС ЯШУРА,ген-ант протека воспрои Как О, более имол огич нтенсивно связывается омплексвми антиген-ан 4) в первые 5-1 0 мин титепо (н при 37 оС еакции. В овышает специ ичность что гет это время оличество счстеме значительное ологи зывается ент миле При езультатов реакци том учетуменьшенипроцессе г ости реагирующейпхзволяет в зна- увствительность мут пе мол смеси в чительн ысить ч гомолог ной системедет медленнее ах к ли глтитело ге герологичт генв. ге ется ант поэтому четко вычем явл различие в реакции мо де гемолио эаргис льт Изобретение относится к области диагностики вирусных болезней, в частности к способам идентификации штаммов вируса ящура для определения типовой и вариантной принадлежности вируса ящура.Известен способ идентификации штаммов вируса ящура, с помощью реакции связывания комплемента, включающий соединение специфического комплекса ачтиген- аититело с гкомппементом с последующим добавлением к реакционной смеси гемопитической системы для проведения иммунного гемолиза, ио результатам которого судят о типовой и вариантной принадлежности вируса.Белью изобретенияявляется ускорение и повышение чувствительности реакции,Поставленная цель достигается тем, что соединение специфического комплекса антиген-аптитело проводят в присутствии вдрйного количества комплемента в течение 5-10 мин, а после добавления к реагирующей смеси гемопитической системы результаты реакции учитывают по степени уменьшении мутности ре .гирующей смеси в процессе гемолиза либо и и последуюрерывании гемолиза, например, центванием, по количеству гемоглобина адочной жидкости этой смеси. авление двойного количества компл к специфическому комплексу антиитело обеспечивает более быстрое ние реакции и получение четкихзводимых результатов, показали исследован и я ком иле ме нтв момент наибольшего различия гомологичной и гетерологччной систем по этому показателю, либо по количеству гемоглобина в реагирующей смеси после прерываниягемолиза, например, центрифугированием,На фиг, 1 графически изображена кинетика иммунного гемолиза; на фиг, 2 -"результаты реакции с ящурным анигеном Остна фиг, 3 - результаты реакции с сывороткой крови бычка, взятой через 21 днейпосле экспериментального заражения вирусом ящура А 22,Способ осуществляют следующим образом.Заранее готовят гемолихическую систему и рабочий раствор комплемента, которые хранят в течение 7-10 дней в холодильнике при температуре 4 оС, Реакциюставят в плавающей панели, изготовленнойиэ тонкого, органического стекла, с луночками объемом. 0,25-0,4 мл, В трех рядахлуночек готовят разведения испытуемогоантигена от 1:4 до 1:256 в объеме 0,1 млдобавляют по 0,025 мл рабочего разведения антисывороток: в луночки первогоряда - 0194, второго - А 2 и третьего- Ост. Йри необходимости можно изменитьнабор штаммов и количество рядов разведений антигена,Затем во,вселуночки вносят по 0,025мл раствора комплемента, и "панель" опускают в водяную баню при 37 оС на 5-10мин, Панель должна плавать на поверхностгводы, По истечении 5-10 мин в моментнаиболее интенсивного связывания комплемента в гомологичной системе во все луночкивно.,ят по 0,025 мл гемсистемы, и панельопускают в ту же водяную баню, На днебани должен быть лист белой. пластмассы счеткой черной сеткой, Степень гемолизаотмечают через каждые 5 мин, Через 10мин, отмечают первые результаты реакции,Отрицательная реакция - через содержимое луночек видна сетка на дне водянойбани, положительная реакция - сетки невидно. Учет результатов производят дотех пор, пока не наступит четкое различие сред по степени мутности в гомологичной и гетерологичной системах, т.е, различие в титрах антигена с антисыворотками различных типов вируса ящура, Результаты реакции заносят в таблицуобозначая цифрой время прохождениягемолиза в каждой луночке в минутах,Обычно читку заканчивают на 15-ой минуте.Результат реакции может быть получен через 30 мин. после поступления антигена па исследованиеПодобным же способом можно исследовать и ящурпые антисыворотки,Результаты реакции могут быть определены при прерывании гемолиза,б Для этого берут 8 пентрифужных пробирок, в три первые пробирки наливаютпо 3 мл испытуемого антигена в разведении 1;100 - 1:200, а в остальные - по32 мл физиологического раствора (рН 7,010 7,2). Затем к ним добавляют по 2 дозыантисывороток (антител) в объеме 0,2 мл:в первую и четвертую пробирку - Ово, вторую и пятую - А, , в третью и2215 шестую - Ост, При необходимости можноизменить или увеличить набор штаммов,После этого, в первые 6 пробирок добавляют по 1 мл рабочего разведения комплемента, а в 7 и 8 пробирки по 1 мл фи 20 зиологического раствора. Все пробиркина 10 мин. помещают в водяную баню при37 С, По истечении 10 мин. в моментонаиболее интенсивного связывания комплемента в гомологичной системе во все пробир 25 ки добавляют гемсистему: в 1, 2, 3 4,5 и 6 пробирки по 0,2 мл, в седьмуюО, 15 мл, в восьмую - 0,1 мл, Пробиркипомещают в ту же водяную баню и выдерживают до тех пор, пока мутность жидкосЭ,ти в 1, 2 и 3 пробирках будет меньшемутности жидкости в 7 пробирке и приблизится к мутности жидкости в 8 пробирке (обычно 8-15 мин,), т.е, до наступления значительных различий в ходе гемолифф за гомологичной. и гетерологичной систем.Этот момент определяется по специаль- но поставленному контролю реакции, Затемиммунный гемолиз прерывают путе центрифугирования реагирующей смеси или путем4 ф добавления ледяного (при ОоС) 5%-ногораствора лимоннокислого натрия, Прерывание иммунного гемолиза осаждением эритроцитов путем центрифугирования:, дает лучшие результаты, так как при этом не происходит дополнительного разведения среды,Все пробирки центрифугируют при 1000в течение 10 мин, что вызывает осаждениенелизированных эритроцитов и прекращениеих лизиса, надосадочную жидкость переливают в кюветы спектрофометра: в ячейкуопыта-поочередно из 1, 2 и 3 пробирок, ав ячейку контроля - соответственно из 4,5 и 6 пробирок. После записи результатовполучают три кривых характеризующих разИличие количества гемоглобина между средами контроля и опыта, При использованииспектрофотометра "Перкин Эльмер" записькривых ведут на волнах в диапазоне 39060420 нм, при использовании спектрофотометров или фотоэлектрокалориметров других систем - нл Волне 412 нм, По высоте пикОВ спектрофотограммы судят О ти"повой и Варчантной принадлежности исследуемого вируса, яшура, а также об активности антигена. Пик, характеризующий реакцию и гомологпчной системе, должен бытьвыше других пиков не менее, чем иа 1,5см (Е = 0,15) (см. график 2 на фиг, 2).В данном случае пик 1 выше пиков 2 иЭ на 8 см (Г = 0,8). Следовательноис- Опытуемый антигенотноси-.ся к Ост.Подобным же образом исследуют и сыворотки крови переболевших ящуром животных. В этом лучае вместо рабочих разведений антисывороток берут рабочие раз бведения антигенов. В качестве примерана фиг, 3 показан результат реакции приисследовании сыворотки крупнот о рогатогоскота, взятой после болезни ящуром,Вирус, вызвавший заболевание животного, 20отнесен к А , так как пик, характеризующий реакцию с данным ентигеном на11,2 см (Е = 1,12) выше остальных пиков,Предложенный способ идентификации Юштаммов вируса ящура с помощью реакциисвязывания комплемента позволяет быстроопредел",:ь тип и вариант вируса ящурапри высокой специфичности реакции,Результаты исследования могут быть 30получены через 30-40 мин после поступления антигена, Чувствительность реакцииспособа значительно выше чувствительности реакции, поставленной по известнойметодике что достигается регистрацией З 5реакции в процессе гемолиза эритроцитов(кинетическая реакция), при этом он является, экономичным, так как значительноуменьшен объем смесей компонентов реак 40:ции, количество рабочих разведений сывороток и гемолитической системы и анти- гена, необходимых для постановки реакции,Предложенный способ целесообразно испольэовать в практических ветеринарных :лабораториях для быстрой идентификации 1 эпизоотических штаммов вируса ящура и определения соответствия эпизоотнческих штаммов вируса производственным для исследования различных вируссодержаших субстратов и определения незначительных количеств ящурного антитепа при проведе,нии различных научных исследовании.Формула . и з о б р е т е н и яСпособ идентификации штаммов вируса ящура включающий соединение спе,цифического комплекса антиген-антитело с комплементом с последующил: добавлением к реакционной смеси гемолитическойсьстемы для проведения иммунного гемолиза по результатам которого судят о типовой и вариантной принадлежности Вируса, о т л и ч а ю ш и й с я тем, что, с целью ускорения и повышения чувствительности реакции, соединение специфического комплекса антиген-антитело проводят в присутствии двойного количества комплемента в течение 5-10 мин, а после добавления к реагирующей смеси гемолитической системы результаты реакции учитывают по степени уменьшения мутности реагирующей смеси в процессе гемолиза, либо при последующем прерывании гемолиэа, напримерцентрифугированием, по количеству гемоглобина в надосадочцой жидкости этойсмеси,Составитель Л Мураяедактор Д. Пинчук Техред М. Левицкая Корректор И. Гоксич 3 101НИИПИ Госуд 1130 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 1 Тиражрственного комитета по делам иэобретени Москва, Ж, Рауш Подписноеовета Министров ССи открытийкая наб., д, 4/5