Способ стерилизации лидазы

БРЕТЕН Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам ПИ САНИПАТЕНТУ(54) СПОСОБ СТЕРИЛИЗАЦИИ ЛИДАЗЫ(19) ЮЛ (11) 2001628 С 1 (51) 5 А 61 Ь 2 00 А 61 Ь 2 08 изобретения - снижение дозы ионизирующеи радиации, уменьшение концентрации радиопротектора и сохранение активности фермента Способ стерилизации лидазы включает растворение фермента в воде, добавление к раствору радиопротектора и стерилизацию раствора ионизирующей радиацией. В качестве радиопротектора используют мексамин в процентном отношении к массе лидазы 1 - 5, а стерилизацию осуществляют при дозе радиации 5 - 10 кГр.Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к медицине,Известен способ стерилизации лидаэы путем фильтрации водных растворов фермента через систему осветляющих и стерилизующих асбестовых фильтров, Недостаток известного способа заключается в его длительности, а также в том, что при стерилизации происходит потеря значительных колицеств фермента (до 20 ф), адсорбирующегося на асбестовых пластинах.Известен способ стерилизации лекарственных веществ с помощью ионизирующей радиации, Однако при стерилизации под действием образующихся свободных радикалов также происходит деструкция лекарственных веществ и снижение или подавление их специфической активности.Известен способ предотвращения разрушения ферментов под действием стерилизующих доз ионизирующей радиации с помощью радиопротекторов - аминоэтилизотиурония, нембутана натрия, цистамина, Ма 2520 или аланина, Однако такой способ требует использования высоких концентраций радиопротекторов (15 - 20 к количеству фермента) и не гарантирует отсутствия накопления токсических веществ возникающих при радиолизе воды,Наиболее близким к предложенному способу является способ стерилизации фармацевтических препаратов, в том числе ферментов, согласно которому стерилизацию водных растворов препаратов осуществляют ионизирующей радиацией, э перед стерилизацией добавляют в качестве радиопротекторое многоатомные спирты. преимущественно маннит,Недостатком известного способа является необходимость использования высоких доз ионизирующей радиации (25 кГр) высоких концентраций радиогротекторое (16 к массе стерилизуемого объекта) а также накопление в растворах продуктов разложения маннита-маннозы и фруктозы л снижение активности ферментов,Целью изобретения является снижение дозы ионизирующей радиации при стерилизации водных растворов лидазы, уменьшение концентрации радиопрстектора и сохранение активности фермента Поставленная цель достигается тем, что при способе стерилизации лидазы, включающем растворение фермента в воде, добавление к раствору радиопротектора и стерилизацию раствора ионизирующей радиацией, в качестве радиопротектора используют мексамин в процентном отношении 1-5 к массе лидазы, а стерили 5 10 15 20 25 30 35 40 15 с,п 55 эацию осуществляют при дозе радиации 5 - 10 кГр,Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что предложенный способ отличается от известного иными приемами стерилизации водных растворов лидаэы, в результате чего достигается полная стерильность растворов и сохранение активности фермента. Таким образом, изобретение соответствует критерию "существенные отличия",Анализ известных решений показывает, что совокупность существенных признаков, заявленных в предлагаемом изобретении, в известных технических решениях обнаружена не была. Это позволяет сделать вывод о соответствии заявленного технического решения критерию "новизна".Испол ь зова ние в п редложен ном способе стадии и параметры процесса стерилизации являются логически обоснованными.На фиг. 1 приведены хроматограммы лидазы (1), мексамина (2) и комплекса лидаза-мексамин (3); на фиг. 2 - спектрометрические кривые растворов лидаэы (1) и лидазы + мексамина (2); на фиг. 3 - антибактериальное действие комплекса мексамин-лидаэа (на культуре Е, со 11 АВ 1157, где А - до облучения, В - после радиационной обработки (10 к Гр) (1 - лидаза, 2 - мексамин, 3 - лидаза + мексамин, 4 - раствор Н 20 (16) - контроль; на фиг. 4 - то же, на культуре Рз. аегицпоза 102,Известно, что в водных растворах белковых веществ, подвергаемых гамма-облучению, протекают деструктивные радиолитические процессы, приводящие к инактиеации белков, Одним иэ основных процессов является их дезаминирование, которое может быть выражено следующей системой уравнений:РОО 1 НО 2 -ф КООН+02ОООН-Н 20 ф ЙОН+Н 202РСОЕНС(ОН)В 2 ф ЯСОМН 2+В 2 СО АСОМ Н 2+Н 20 + ВСООН+ИНзВведение радиопротекторов предотвра:.цвет эти процессы и способствует сохранению акгивности ферментов, Однако ни один из известных протекторов не защищал е пол 1 ой степени водные растворы лидазы от разрушения при гамма-стерилизации.Иная картина наблюдалась при использовании в качестве радиопротектора препарата мексамина, являющегося по химической природе хлпридгидратом 5-метокситриптаминафМНмексамин, 2001628510 Выбор этого соединения объясняется его известными радиоэащитными свойствами и высокой реакционной способностью. Можно полагать, что при взаимодействии лидазы с мексамином в водном растворе образуется новое комплексное соединение возможно эа счет реакции аминогрупп мексамина с карбоксильными или другими функциональными группами молекулы фермента.При этом не исключено, что происходит блокирование наиболее уязвимых фрагментов макромолекул фермента радиопротектором и преграждается доступ к его каталитическим центрам молекулярного кислорода, оказывающего повреждающее действие.Факт образования такого комплекса был подтвержден в результате хроматографического и спектрального излучения растворов лидазы и мексамина (см, фиг. 1 и 2), где было зарегистрировано изменение величин Рт и абсорбционных кривых в УФ-области спектра.При стерилизации водных растворов лидазы в отсутствии радиопротектора происходит прогрессирующая потеря активности фермента в зависимости от дозы излучения. При использовании дозы 25 кГр активность лидазы снижается на 30 от исходной величины, а при снижении дозы до 10 кГр - на 15 - 20 . Оптимальное действие мексамина в качестве протектора имеет место при его концентрации 1-5 к массе лидазы. В этом случае особенно отчетливо проявляются не только радиозащитные свойства мексамина, но и выявляется синергическое бактериостатическое или бактерицидное действие комплекса лидаза - мексамин в отношении Е, со и Рз, аегадпоза (см, фиг, 3 и 4),П р и м е р 1, 100 г ацетонированного порошка субстанции лидазы активностью 256 усл. ед/100 мг растворяют в 4 л воды из расчета 64 усл. ед/мл, раствор фильтруют для удаления механических примесей и к фильтрату (степень контаминации 3,8 10 кол/мл), добавляют 1 г (1; к массе лидазы) мексамина. Смесь перемешивают до полного растворения мексамина и подвергают облучению на изотопной облучательной установке ( Со) мощностью дозы 10 кГр/ч60при дозе радиации 5 кГр, Препарат лидазы после радиационной обработки сохраняет активность 64 усл. ед/мл.Контроль стерильности облученных препаратов проводили путем посева на плотную питательную среду (МПА) и в стандартную жидкую тиогликолевую среду, Установлено отсутствие микробной 15 20 25 30 35 40 45 50 55 контаминации обработанного препарата как на плотных, так и на жидких питательных средах, Стерльный препарат разливают в асептических условиях по 1 мл и сублимируют. Полученный препарат удовлетворяет требованиям фармакопейной статьи на лидазу (ФС 42 - 2606 - 88),П р и м е р 2. 100 г ацетонированного порошка субстанции лидазы активностью 256 усл, ед/100 мг растворяют в 4 л воды из расчета 64 усл. ед/мл, раствор фильтруют для удаления механических примесей и к фильтрату (степень контаминации 3,4 10 кл/мл) добавляют 2,5 г (2,5к массе лидазы) мексамина, Смесь перемешивают до полного растворения мексамина и подвергают облучению на изотопной облучательной установке (оСо) с мощностью дозы 10 кГр/ч при дозе радиации 7,5 кГр. Получают полностью стерильный раствор лидазы активностью 64 усл. ед/мл, который разливают в асептических условиях во флаконы по 1 мл и сублимируют. Полученный препарат удовлетворяет требованиям фармакопейной статьи на лидазу (ФС 42-2606-88),П р и м е р 3, 100 г ацетонированного порошка субстанции лидаэы активностью 256 усл. ед/100 мг растворяют в 4 л воды из расчета 64 усл. ед/мл, раствор фильтруют для удаления механических примесей и к фильтрату (степень контаминации 3,1 10 кл/мл) добавляют 5 г (5 фк массе лидазы) мексамина, Смесь перемешивают до полного растворения мексамина и подвергают облучению на изотопной облучательной установке ("оСо) с мощностью дозы 10 кГр/час при дозе радиации 10 кГр, Получают полностью стерильный раствор лидазы активностью 64 ед/мл, который разливают в асептических условиях во флаконы по 1 мл и субл им ируют. Полученный препарат удовлетворяет требованиям фармакопейной статьи на лидазу (ФС 42 2606 - 88).При изменении заявленной совокупности существенных признаков положительный эффект не достигается, что подтверждается сравнительными примерами 4 - 9,П р и м е р 4. 100 г ацетонированного порошка субстанции лидазы активностью 256 усл. ед/100 мг растворяют в 4 л воды и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что перед стерилизацией мексамин не добавляют. Получают раствор лидазы, в котором уровень контаминации составляет 2,4 10 кл/мл, а активность фергмента 54 усл, ед/мл,П р и м е р 5. 100 г ацетонированного порошка субстанции лидазы активностью256 усл. ед/100 мг растворяют в 4 л воды и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что вместо мексамина добавляют 1 г хлоргидрата цистеамина (НЯСН 2 СН 2 ЙН 2 НС). Получают раствор лидазы, в котором ровень контаминации составляет 0,4 10 кол/мл, а активность фермента 56 усл. ед/мл.П р и м е р 6. 100 г ацетонированного порошка субстанции лидазы с активностью 256 усл. ед/100 мг растворяют в 4 л воды и далее поступают как в примере 1, за исключением того, что добавляют 0,5 г мексамина (0,5 ф, к массе лидазы), Получают раствор, в котором уровень контаминации составляет 0,2 10 кол/мл, а активность лидазы - 50 усл. ед/мл.П р и м е р 7. 100 г ацетонированного порошка субстанции лидазы активностью 256 усл. ед/100 мг растворяют в 4 л воды и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что добавляют 6 г мексамина (6 к массе лидазы). Получают полностью стерильный раствор лидазы активностью 64 Формула изобретения СПОСОБ СТЕРИЛИЗАЦИИ ЛИДАЗЫ путем растворения фермента в воде, добавления к раствору радиопротектора и стерилизации раствора ионизирующей раусл/ед/мл, что свидетельствует о нецелесообразности повышения концентрации мексамина в растворе.П р и м е р 8, 100 г ацетонированного 5 порошка субстанции лидазы активностью256 усл. ед/100 мг растворяют в 4 л воды и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что доза радиации составляет 2,5 кГр, Получают раствор лидазы с уровнем 10 контаминации, близким к исходному (5,0 хх 10 кол/мл).П р и м е р 9, 100 г ацетонированногопорошка субстанции лидазы активностью 25 усл. ед/100 мг растворяют в 4 л воды и 15 далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что доза радиации составляет 15 кГр. Получают полностью стерильный раствор лидазы с расчетной активностью (64 усл, ед/мл), что свидетельствует о неце лесообразности повышения дозы радиации.(56) Заявка Великобритании М 2222081, кл. А 61 К 41/00, 1990,25 диацией, отличающийся тем, что, с целью сохранения активности фермента, в качестве радиопротектора используют мексамин в процентном отношении 1 - 5 к массе лидазы, а стерилизацию осуществляют радиацией при дозе 5-10 кГр,