Способ определения устойчивости растений к стрессовым воздействиям

)5 А 01 6 7/00 ПИС ИЕ ИЗОБ Т ВТОРСКО ИДЕТЕЛ ЬСТВ 34огии рас ий и генеВ.Д.Мануильскии,матько и С.В, Мануи, 4 ос О ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР(71) Институт физитики АН УССР(54) СПОСОБ ОПВОСТИ РАСТЕНИДЕЙСТВИЯМ(57) Использованспособы установлтойчивости растен детельство СССР1 6 7/00, 1988,РЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИЙ К СТРЕССОВЫМ ВО ие: сельское хозяйство, ения потенциальной усий к комплексу стрессоИзобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к способам установления потенциальной устойчивости растений к комплексу стрессовых факторов (водному, низко- и высокотемпературному стрессам) и может быть использовано в практике генетика-селекционных работ при создании высокопродуктивных, устойчивых к факторам внешней среды растений, Для создания новых прогрессивных технологий необходимы сорта, обладающие высокой устойчивостью к неблагоприятным факторам среды, В этом плане актуальным является поиск интегральных способов оценки устойчивости растений к экстремальным воздействиям (эасухо-, жара- и морозоучтойчивость). Исходя из экспресс-информации о состоянии фотосинтетического аппарата растений, можно суммировать многие ответные реакции растительного организма,вых факторов. Сущность соб определения устойчи стрессовым воздействия ние водного эстракта ли определение оптическо тракта при 260 - 280 нм и пути 0,5 см. В качестве эк зуют раствор с рН 3,0 - 3,8 бранным злектролиэом камере. Экстракцию ве 35 мин при температуре вом соотношении листь Сорт считают устойчивь ская плотность )кстра равна 0,9, и неустойчивы ше 0,9. 4 табл,изобретения: сповости растений к включает получестьев растений и й плотности эксдлине оптического стаогента испольполученный мемводы в анодной дут в течение 2519 - 21 С и весоя:экстрагент 1:10.м, если оптичекта больше или м, если она меньСуществует ряд методов, позволяющ определять реакцию растения на воздей вие неблагоприятных факторов среды,Так, в настоящее время известны способа оценки морозоустойчивости озимых зерновых культур путем определения количества калия, перешедшего в раствор после охлаждения (авт. св. СССР гч. 1207431, кл, А 01 С 7/00, 1986), а также способ определения засухоустойчивости растений по выходу электролитов из листьев пшеницы в раствор в результате его прогрева при 30-45 С в течение 4-6 часов (авт, св, СССР ч. 791328, кл, А 01 6 7/00, 1980). Однако, данные способы позволяют определять морозо- и засухоустойчивость растений лишь в случае воздействия стрессового фактора и возникновения повреждений клеток, в том числе и без оценки степени устойчивости растений в нормальном функциональном состоянии, т. к. выход электролитов из клеток листа усиливается только в условиях летального повреждения, при глубоком обезвоживании мембран и клетки в целом, Кроме того, выход электролитов зависит от уровня оводненности тканей, что при засухе существенно усложняет процедуру измерений, т. к. для объективной оценки требуется регидратация тканей и сопоставление с их устойчивостью, которая при этом возникает (Кожушко Н,Н, Выход электролитов как критерий оценки засухоустойчивости и особенности его использования для зерновых культур // Методы оценки устойчивости растений к неблагоприятным уловиям среды. Всесоюзный НИИ растениеводства им, Н.И. Вавилова, Ленинград, - Колос. 1976, с, 32 - 43),Наиболее близким по технической сущности является выбранный авторами в качестве прототипа способ определения засухоустойчивости многолетних растений (авт. св, СССР М 1371612, кл. А 01 С 7/00, 1988) путем измерения буферности рН водной вытяжки растительной ткани, при этом чем выше буферность рН водной вытяжки, тем устойчивее растение к засухе,Данный способ осуществляется следующим образом.Отбирают среднюю пробу или побегов, или почек, или листьев у многолетних растений, произрастающих на фоне недостаточной влагообеспеченности (засухе). Для этого навеску 1 кг 10 в 5-кратной повтор-зности тщательно растирают в ступке с дистиллированной водой и переносят в ячейку для измерения рН, Общее количество воды 10 м, После замера рН в ячейку для измерения с пробой добавляют 5 10 м 0,1 н. НС), перемешивают и снова замеряют. По разнице в значениях рН до и после добавления кислоты устанавливают процент сдвига рН.Однако, хотя этот способ и исключает предварительное воздействие стрессового фактора, но он дает лишь одностороннюю, приблизительную и не точную информацию о степени устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды, т, к, в течение онтогенеза растения находятся в зоне действия комплекса неблагоприятных факторов - в летнее время они подвергаются губительному действию почвенной засухи и высоких температур воздуха, а в зимний период - низких температур, Наряду с этим величина рН в интервалах, измеряемых авторами, в значительной степени зависит от многих физических (температу 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ра, качество электродов, степень гомогенности среды и др.) и химических (диссорциация ионов, скорость растворения. плотность среды, скорость диффузионных процессов и др,) показателей. Поэтому получение незначительных различий в величинах рН не всегда будет определяться экстрагированием веществ из клеток и тканей растения,Предложенный авторами физико-биохимический показатель, основанный на установлении процента сдвига рН, является попыткой выявить значительные количественные изменения только лишь малых сдвигов рН и не является достаточно корректным и точным при проведении расчетов. Поэтому актуальное значение имеет возможность получения интегральной характеристики устойчивости растений к комплексу стрессовых воздействий,Целью предполагаемого изобретения является повышение точности способа определения.Поставленная цель достигается тем, что способ определения устойчивости растений к стрессовым воздействиям предусматривает погружение сегментов листьев растений в электролит - раствор, полученный мембранным электролизом воды в анодной камере (анолит), с рН 3,0 - 3,8 в течение 25 - 35 мин при температуре 19 - 21 С и измерение оптической плотности экстракта при длине волны 260 - 280 нм с помощью двухлучевого спектрометра 356 фирмы "Хитачи" (Япония). По этому интегральному показателю судят о степени устойчивости растений к комплексу стрессовых факторов - почвенной засухе, низким и высоким температурам воздуха, считая сорт устойчивым, если этот показатель составляет 0,9 и более, и неустойчивым, если он менее 0,9,Выбор среды рН, при котором производили экстракцию листьев обусловлен тем, что при данных значениях рН, благодаря явлениям осмоса и денатурации белков, в раствор переходят входящие в плоскость мембраныф липиды, которые связаны с белками, Степень выхода липидов изменяет оптическую плотность раствора и позволячет характеризовать общее функциональное состояние растительного организма,Продолжительность экспонирования листьев в растворе связана с тем, что при коротких экспозициях наблюдается недостаточная чувствительность спектрометра, а при длительных - экстрагируются и другие вещества, которые вносят искажение в спектр поглощения и смещают максимум поглощения среды, Кроме того, при более блительных процессах экстракции водный50 55 раствор несколько окрашивается за счет извлечения пигментов, что также вносит искажение в показания спектрометра,Проведение измерений в интервале температур среды 19 - 21 С определяется интенсивность перекисного окисления липидов. Более низкие темперетуры среды усложняют измерения, а более высокие - сильно активируют перекисное окисление жирных кислот липидов, что отражается на величине оптической плотности раствора в исследуемом участке спектра,Проведение измерений в полосе спектра 260-280 нм связано с тем, что в этой области спектра происходит поглощение коротковолновой радиации полярными липидами мембран, которые входят в светособирающий комплекс фотосинтетического аппарата листа, а это особенно существенно для характеристики изменений процесса транспорта электронов и возможности их перестройки при неблагоприятных условиях среды.Сущность предлагаемого способа подтверждается примерами конкретного выполнения,П р и м е р 1. В качестве электролита в опытах использовали анолит - воду, полученную мембранным электролизом обычной воды в анодной камере. рН анолита - 3,0 - 3,8+ 0,1, Термин "аналит" или "анодная жидкость" употребляется в специальной химической литературе Химический словарь. Под ред, С, Собецкой, В, Бернацкого, Д, Крыт, Т. Задорожной (при участии Г, Стиван и Т, Стиван), - Варшава: Научно-техническое издательство, - 1962, с, 32), Электролиз проводили втечение 35 мин при постоянном напряжении 220 В и силе тока 200 мА при обычных условиях. Материалом для катода служила нержавеющая сталь марки ЛХ 15 Н, содержащая карбид железа (РезС), а анодом - карбид кремния карборунд, ЯС), которые обладают высокими противокоррозионными свойствами. Расстояние между электродами составляло - 40 мм, На катоде происходил процесс восстановления катионов (отдает электроны катионам), а на аноде - процесс окисления анионов (принимает электроны от анионов),П р и м е р 2. Листья озимой пшеницы засухоустойчивого сорта Одесская 51, взятые в фазу трубкования, помещали в кварцевую кювету с раствором, рН которого равно 2,6; 3,0; 3,4; 3,8. 4,2, выдерживали при температурах среды 18 С, 19 С, 20 С, 22 С в течение 30 мин. Затем образовавшийся экстракт переносили в кварцевую кювету толщиной 0,5 см и измеряли оптическую 5 10 15 20 25 30 35 40 плотность раствора с помощью двухлучевого спектрометра 356 фирмы "Хитачи" (Япония) при длине волны 270 нм, Результаты измерений приведены в табл, 1.П р и м е р 3. Листья озимой пшеницы засухоустойчивого сорта Одесская 51, взятые в фазу трубкования, помещали в кварцевую кювету с раствором, рН которого 3,4, и выдерживали при температуры среды 20 С в течение 20, 25, 30, 35 и 40 мин. Затем образовавшийся экстракт переносили в кварцевую кювету толщиной 0,5 см и измеряли оптическую плотность раствора с помощью двухлучевого спектрометра 356 фирмы "Хитачи" (Япония), при длине волны 250 нм, 260 нм, 270 нм, 280 нм, 290 нм. Результаты измерений приведены в табл, 2.Как следует из данных, приведенных в табл, 1 и 2, наиболее оптимальными условиями для экстракции веществ из листьев растений является рН раствора 3,4, температура среды 20 С, продолжительность процесса экстрагирования 30 мин и измерение оптической плотности раствора при длине волны 270 нм.Для проверки эффективности способа проводили опыты с сортами растений, различающихся по своей устойчивости к стрессовым воздействиям.П р и м е р 4, В опыте использовали сорта озимой пшеницы Одесская 51, Ровенская 49, Мироновская 808, Кишиневская ранняя, Чайка и Белоцерковская 47, а также сорта картофеля Темп, Прикарпатская, Гатчинский и Мавка. С этой целью готовили водные экстракты листьев пшеницы на фазе появления 4-го листа, а картофеля - на фазе начала цветения в растворе с рН 3,5 при температуре 20 С и продолжительности процесса экстракции - 30 мин. Оптическую плотность экстрактов листьев определяли при длине волны 270 нм на спектрометре 356 фирмы "Хитачи" (Япония), Параллельнов опыте определяли оптическую плотностьэкстрактов по заявляемому нами способу и с помощью стандартной буферной смеси раствора, включающего 6,05 мл 0,2 М йагНРО 4 и 13,9 мл 0,1 М лимонной кислоты, имеющего диапазон рН от 2,2 до 8,0 притемпературе от 15 С до 30 С (Перельман В,И, Краткий справочник химика, - М.: 1951, с. 498).В результате экспермиента установлено, что экстрагирование органических и неорганических веществ из листьев растений по предлагаемому нами способу с помощью электролита - раствора, полученного мембранным электролизом воды в анодной камере (анолит), является существенно болееэффективным, чем буферной смесью растворов (табл. 3), Следовательно, применение буферной смеси растворов не позволяет выявить достоверные различия между исследуемыми сортами в коэффициентах оптической плотности, Это обусловлено тем, что химические вещества буферного раствора могут образовывать нерастворимые соединения и комплексы и давать нежелательные реакции со срезой (Бейтс Р. Определение рН, Теория и практика. - Ленинрад, отд., Химия, 1972. - Изд. 2-е, с, 114), подавлять синтез многих ферментов и вызывать дезорганизацию структуры и функций мембран растительной клетки (Гизе А. Физиология клетки, - М.; Изд. ИЛ, - 1959, с. 43-54; Гродзинский А.М., Гродзинский Д.М. Краткий справочник по физиологии растений. - Киев; Наук, думка, 1964, с, 301),Среды обычных растворителей вода отличается наиболее высокой диссоции рующей (ионизирующей) способностью (Кульман А.Г, Общая химия, - М.: Изд. с.-х. литературы, журналов и плакатов. 1961, с.217; Бейтс Р. Определение рН. Теория и практика. - Ленинград, отдХимия, 1972, - изд. 2-е, с, 162) и, по сравнению с буферными смесями растворов, является нетоксичным, сравнительно энергетически дешевым и легко регенирируемым экстрагентом (Химический энциклопедический словарь. - М.: Советская энциклопедия, Гл, ред. И.Л, Кнунянц. - 1983, с, 693).Таким образом, можно сделать заключение, что для осуществления предлагаемого нами способа какой-либо раствор веществ любой концентрации с низкими значениями рН неприемлем, поскольку стандартные буферные смеси растворов оказывают ингибирующее влияние на процессы экстракции веществ из листьев растений и не могут использоваться для определения устойчивости растений к стрессовым воздействиям,П р и м е р 5, В опыте использовали сорта озимой пшеницы Одесская 51, Ровенская 49, Мироновская 808, Кишиневская ранняя, Чайка и Белоцерковская 47, а такуже сорта картофеля Темп, Прикарпатский, Гатчинский и Мавка. С этой целью готовили водные экстракты листьев исследуемых сортов растений(для озимой пшеницы на фазе появления 4-го листа, для картофеля на фазе начала цветения) в водном растворе с рН 3,5 при температуре 20 С и продолжительности процесса экстракции 30 мин. Оптичес кую плотность экстракта определяли при длине волны 270 нм на спектрометре 356 фирмы "Хитачи" (Япония). Параллельно в 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 опыте определяли степень устойчивости растений озимой пшеницы и картофеля к стрессовым воздействия по способу-прототипу (табл. 4),Полученные экспериментальные данные по способу-прототипу свидетельствуют, что по разнице в значениях рН до и после добавления кислоты не возможно установить существенные достоверные различия и точно оценивать степень устойчивости растений к комплексу стрессовых факторов среды,Для подтверждения целесообразности предложенного нами способа в опыте определяли снижение продуктивности исследуемых растений под воздействием стрессовых факторов(почвенной засухи, низких и высоких температур воздуха).С этой целью активно вегетирующие растения подвергали воздействию низко-, высокотемпературного и водного стрессов в камерах искусственного климата ВКШи КНТ; низкотемпературный стресс создавали путем промораживания растений до -15 С в течение 2-х суток, высокотемпературный стресс создавали путем выдерживания растений при температуре +40 С в течение 4-х часов, а условия почвенной засухи создавали путем прекращения полива растений в течение 12 суток, При этом влажность почвы в сосудах снижалась до 25 от ее полной влагоемкости, а водный дефицит листьев увеличивался до 45,6 .Результаты исследований показали (табл, 4), что у сортов растений, обладающих устойчивостью к комплексу стрессовых факторов среды, оптическая плотность экстракта существенно увеличивается от 091 до 1,12 (т. е. составляет 0,9 и более). Напротив, для неустойчивых сортов растений к комплексу стрессовых факторов среды характерно существенное снижение этого показателя от 0,86 до 0,75 (т. е, менее 0,9). Следует отметить, что способ-прототип предназначен для оценки устойчивости растений только к засухе и не пригоден для определения и оценки устойчивости их к комплексу стрессовых факторов среды. Измеренные нами по способу-прототипу величины не дают возможности выявить достоверные различия между исследуемыми сортами озимой пшеницы и картофеля ввиду низкой точности и незначительной разницы в измеренных значениях рН,В то же время заявляемый нами способ является более эффектвным, чем способ- прототип, т. к, позволяет более надежно оценивать непосредственно устойчивость мембранных структур, которые являются адаптивными мишенями клетки иинтеграль 1761047 1040 45 г-и 55 но отражают потенциальную устойчивость растений к комплексу стрессовых факторов среды. Кроме того, данный способ отличается существенно более высокой точностью, поскольку дает возможность без непосредственного воздействия стрессового фактора характеризовать потенциальную устойчивость и функциональную активность фотосинтетического аппарата растений к водному, низко- и высокотемпературному стрессам.В предл;" аемом нами способе впервые предложено экстрагирование веществ из листьев растений с помощью электролита с низкими значениями рН, полученного мембранным электролизом воды в анодной камере с применением специальных некорродирующих электродов. Это позволяет по сравнению со способом - прототипом получать существенно более высокий положительный эффект, который достигается за счет более высокой разности потенциалов, возникающих между внешней и внутренней поверхностью клеточных мембран листьев растений (рН клетки 6,2, слабо кислая реакция) и электролита - раствора, полученного мембранным электролизом воды в анодной камере(анолит, рН 3,5, крайне кислая реакция), Такие существенные различия обеспечивают более полное и равномерное извлечение из листьев не только органических и неорганических веществ, но также и белков и, особенно, липидов, которые регистрируются по спектрам поглощения только при длине волны 260 - 280 нм и измеряются с помощью двухлучевого спектрометра 356 фирмы "Хитачи" (Япония). Важно отметить, что добавление к воде кислоты не дают положительного эффекта,В предлагаемом нами способе экстрагирование веществ из листьев растений происходит за счет осмоса, вызывающего передвижение воды из раствора, имеющего высокий водный потенциал (ВП), в раствор с низким ВП. При осмосе молекулы воды поступают через полупроницаемую мембрану в гипертонический раствор до тех пор, пока ВП с обеих сторон не станет одинаковым (Рейвн П., Эверт Р., Айкхорн С. Современная ботаника, - М,: Мир, ч. 1, 1990, с, 65 - 66). Таким образом, определение устойчивости растений к комплексу стрессовых факторов по способу-прототипу является существенно менее точным, чем определение устойчивости растений к комплексу стрессовых факторов по заявляемому нами 5 10 15 20 25 30 35 способу с помощью электролита - водно о раствора с рН 3,0 - 3,8, полученным мембранным электролизом воды в анодной камере. Это обусловлено тем, что условия опыта в способе-прототипе не позволяют точно регистрировать с помощью селективного электрода малые изменения рН водного экстракта листьев и вносят существенную погрешность в такой незначительно изменяющийся показатель как измеряемая разница рН,Из литературы (Кульман А,Г. Общая химия, - М.: Изд. с.-х. литературы, журналов и плакатов. 1961, с, 226) известно, что чем раствор более кислый, тем выше в нем концентрация водородных ионов и тем меньше рН. Это означает, что активность растворов воды - как амфотерного электролита, зависит от рН. В кислых средах концентрации ионов водорода выше, а в щелочных - наоборот - ниже, (Сена Л.А. Единицы физических величин и их размерности. - М.: Наука. Главная редакция физико-математической литературы. 1988, с, 431).Предлагаемый нами способ может быть использован в селекции для отбора и сравнительной оценки степени устойчивости районированных сортов и перспективных линий и форм растений к водному, низко- и высокотемпературному стрессам, Полученные количественные данные по заявляемому способу могут быть также применены при исследовании механизмов. устойчивости и адаптации растений к неблагоприятным факторам среды при их выращивании в контрастных поч ве н но-кл иматических зонах,Формула изобретения Способ определения устойчивости растений к стрессовым воздействиям, включающий приготовление водного экстракта листьев растений и определение физиолого-биохимического показателя экстракта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, экстракцию осуществляют в течение 25 - 35 мин при 19 - 21 водным раствором с рН 3,0 - 3,8, полеченным мембранным электролизом воды в анодной камере, при массовом соотношении листья: экстрагент 1;10, а в качестве физиолого-биохимического показателя определяют оптическую плотность экстракта при длине волны 260 - 280 нм и длине оптического пути 0,5 см и отномят сорт к устойчивому при показателе, большем или равном 0,9, и неустойчивому, если менее 0,9,1761047 Таблица Влияние рН растворов и температуры среды на оптическую плотность экстракта листьев озимой пшеницы сорта Одесская 51 при длине волны 270 нм Температура среды С Варианты опыта 22 18 19 20 Оптическая плотность экстракта листьев (Кд) ) в относительных е ини ах Зкстракция листьев при рНраствора:26 0,39-0,04 0 ю 8 0,05 0,7840)04 0,3740, 05 0,4740,06 0)42 ьО 03 0,614 005 0)77 тО 04 0,690,06 0,960,06 0,81+ 0, 05 0,8740,07 0730,02 0,7540,06 о 6440,04 С 0,01 0,58+0, 07сО 0 0,67.0,05С 0,02 0,73.0,07 СО,ОО Таблица 2Влияние длительности экстракции и длины волны на оптическую плотность экстракталистьев озимой пшеницы сорта Одесская 51 при РН раствора 3,4 Варианты опыта Длина волны нм 250 Оптическая плотность экстракта листьев (Ко) в относительныхединицами Длительность экстракции листьев, мин: 0,6640)07 0,78+0,05 0,74 .0,02 0,83.0,07 0,64 40,03 0)72 з 0,03 0,7 з 0,06 0,790,08 09640,01 0,90;0,03 0,87 Ф 0,06 0,74-0,07 0)830,05 0,8040 02 0,79 О, 01 О, 89 О, 03 079-0)02 075 -005 к 0,02 (0)0 О,ОО ,.О,ОО ,0,02 Таблицз 3Сравнительные даииыв устойивости растений к стрессовым воздействиямпри зкстрагиОвании веществ из листьев по заявляемому сгюсобуи с помощью бу;ериой смеси растворов Исследуемые сорта КОЗФФИЦИЕИт ОПтИЧЕСКОй П)отИОСтн Ка ть (В Относительных единицах) при зкстрагироваиии веществ из листьев электролитом"раствором)полученном мембраннымзпектропизом воды ваиодиой камере (аиопит,рН 3,5) по заявляемомуспособу о,96+0,06 0,86 ФО 06,84.О,ьООО 3,0 3,4 3,8 4,2 Р 20 25 30 35 40 Озимая пшеницаОдесская 51Ровенская 49Мироновская 808Кишиневская ранняя 0,540,04 0)62+0,05 0,83 ь 0,040,86-0,07 04140,04 0,53006 0,814 0,07 0,87".О, 07 0,8610,02 0,8810,02 буФерной смесью растворов (рН 3,5), включающей 6,05 ип О 2 П Яа НРОЧ и3,9 мп О) М лимонной кисоты 0,52 сО 03Оз 5200О 524002С 005 06 зО,С 062 зз 0,60 зО,О 0)59 зО,О 059 О) 05 0,83 ьО 07 0,71+0,08 ( 0,6)ф О, 08 (О, 001сч Ю л О +1 0 л О х К Х в т Я Я о о .)1 1 1 Е О О 3- 1- О О ГОа асй ос оШ ОО ОО ОЕГО О) х О х Б ГО т х 1- й ГО ГОаШ ГОГОХ ООО Вв шсс оС) О.