Способ получения h-y-антисыворотки для определения пола при пересадке эмбрионов

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН Я,.",-.,К ПАТЕНТУИ ф.-,(г 1) 50 з 15 Во/1 з(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Н-У-АНТИСЫВОРОТКИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛА ПРИПЕРЕСАДКЕ ЭМБРИОНОВ(51) А 61 К 9 9 01 ЯЗЗ 7 нии антисывороток применяемых для определения пола у млекопитакхцих при пересадке эмбрионов Сущность применения: иммунизируют самок путем введения в их селезенку частиц кожи сингенного самца Через 15 - 20 дней у самок отбирают кровь для приготовления из нее Н - У - антисыворотки Спустя 7 - 25 дней однократно или через тот же срок повторно проводят поддерживающую иммунизацию инъекциями 35-40 х 10 клеток селезенавсингенного самца внутрибрюшинно. 2 таблменения Н-У-антисыворотки обнаруживают Н-У-антиген на бластомерах эмбрионов практически у всех видов млекопитающихживотных, Известный препарат Н-У-антител может быть использован для идентифи кации пола любых клеток.Основные недостатки этого метода - трудоемкость процедуры ч ее продолжительность. Она включает 2-3-раэовые иммунизации в неделю на протяжении 3-4 Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении антисывороток, применяемых для определения пола у млекопитающих при пересадке эмбрионов,Известен способ получения Н-У-моноклонального антитела - гиклоналана, имеющего селективное связывающее родство к антигену Н-У. Иммунологический способ для идентификации и отделения мужских клеток от женских половых клеток включает контакт смешанных мужских и женских клеток с моноклональным внтителом - гиклоналаном; селективную иммунологическую реакцию между мужскими клетками и гиклоналаном, имеющую результатом комплекс антител мужских клеток; обнаружение данного комплекса и отделение женских клеток от данного комплекса 1,Главная особенность моноклонвльных антител, получаемых известным способом, - идеальная однородность (гомогенность), Свойства таких препаратов антител длительное время остаются постоянными. Однако значительным недостатком известного способа является высокая стоимость моно- клонов из-за трудоемкости их получения. Кроме того, в ряде случаев моноклональные антитела, как и поликлонвльные, могут проявить низкую аффинность, В результате часть антигенов может остаться невыявленной, В таких случаях необходимо проведение оценки и отбора реагентов (сывороток) лучшего качества.Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ получения Н-У-антисывороток путем многократных внутрибрюшинных иммунизаций высокоинбредных мышей линии С 57 В/6 2). При этом реакция взаимодействия антигена с антителом выявляется после связывания с ФИТЦ-коньюгатом (флуоресцеиноэотиоцианат) комплекса антиген-антитело. В случаеположительной реакции, т.е. связывания Н-У-антител с антигеном, в флуоресцентном микроскопе выявляют желто-зеленое свечение (флуоресценция). Такие флуоресцирующие эмбрионы развиваются у самцов, а несветящиеся - у самок. Посредством при 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 недель с последующими добавочными иммунизациями через каждые две недели. При, этом нужно готовить антиген путем многократного промывания клеток селезенки самцов в заданной дозе: 35 - 40 10 клеток в 0,1 мл.Цель изобретения - повышение эффективности способа.Это достигается тем, что в известном способе, включающем введение антигена, отбор сыворотки, постановку тестов на обнаружение Н-У-антигена, особенностью является то, что выработку Н-У-антител проводят внутриселезеночной иммунизацией самки частйцами кожи сингенного самца с последующими одно- или двукратными добавочными внутрибрюшными реиммунизациями 35-40 10 клеток селезенки синагенного самца.В процессе исследований было установлено, что оптимальным является сочетание внутриселезеночной иммунизации инбредных мышей линии С 7 В/б с добавочными реиммунизациями (1-2 раза) через 7-25 дней, По своим качествам полученная таким образом энтисыворотка при аттестации эмбрионов не уступает той, что была получена известным способом, т.е. многократными внутрибрюшными инъекциями 35-40 10 клеток селезенки сингенного самца.Принципиальное отличие предлагаемого способа получения Н-У-антител методом внутриселезеночной иммунизации (трансплантации) кусочками кожи самца самок от обычных внутритканевых иммунизаций, внутримышечной, внутрикожной и др. типов иммунизаций заключается в механизме протекающих при атом процессов,Так, на начальном этапе иммунизации имеет место активный синтез Н-У-антигена, возникающий вследствие пролиферэции клеток прижившегося трансплантата. Непосредственный контакт вновь синтезируемых Н-У-антигенов с иммунокомпетентными клетками селезенки обеспечивают высокий уровень иммунного ответа на укаэанный слабый антиген. Обычно после 10- 12 дней пересадки трансплантата наблюдаются острая реакция отторжения организмом самки мужского трансплантата - источника Н-У-антигенов, его последующее разрушение и изоляция. Этот процесс сопровождается формированием высокого уровня Н-У-антител в сыворотке крови, Этого результата трудно достигнуть другими методами из-за низкой плотности распределения Н-У-антигена на тканях и крайне низкой иммуногенности этого анти- гена.Поэтому сыворотки (антисыворотки), полученные другими методами, обычно характеризуются низкими титрами, несмотря на продолжительность иммунизаций. Таким образом, при обычных способах иммунизации имеют место дефицит и недостаточная концентрация антигена в иньецируемой смеси (если используются еще и адъюванты),Попытки удаления из Н-У-сывороток контаминированных аутоантител часто приводят к инактивации сывороток и невозможности их использования для определения пола эмбрионов.Вышеперечисленные трудности в значительной мере устраняются при использовании метода внутриселезеноч ной иммунизации в первую очередь эа счет получения Н-У-сывороток с высокими титрами и такого качества, которые бы были способны обнаруживать антигены на бластомерах ранних эмбрионов.Полиморфизм Н-У-антигена представлен 3 типами: серологически выявляемый и соответственно обозначаемый как Н-У идентифицируемый цитотоксическими Т- клетками -Н-Ус и идентифицируемый методом трансплантации -Н-У 1. Взаимоотношения между указанными типами антигенов не изучены.Исследования показали, что в полученных сыворотках содержатся антитела к антигену Н-Уэ, т,к. с помощью полученных сывороток удается дифференцировать Н-У и Н-У эмбрионы серологическим методом. Следовательно, повышение эффективности способа с помощью заявляемого изобретения заключается в том, что в результате внутриселеэеночной иммунизации самки кусочками кожи сингенного самца получена активная сыворотка, содержащая Н-У-а нтитела, направленные к Н-У-антигену ранних эмбрионов, т,е. способная выявлять наличие антигена самцов на бластомерах ранних эмбрионов.П р и м е р. Внутриселезеночную иммунизацию проводили в опыте на 5 самках С 57 В 1/6, Под ветбуталовым наркозом, разрезом с левой стороны, на боку достают селезенку, в которую с помощью иглы вводят по 3-4 кусочка кожи хвоста самца диаметром около 1 мм и зашивают разрез. Спустя 15- 20 дней у них отбирают кровь для получения Н-У-антисыворотки, в дальнейшем поддерживающие иньекции антигена (реиммунизация) делают с интервалом 7-25 дней, Реиммунизация, как с меньшим, так и с большим интервалом, по сравнению с отмеченным дает меньший титр Н-У-антисыворотки. Доза антигена - суспензии клеток10 15 селезенки сингенного самца составляла 35- 40 10 клеток. Иньекции антигена проводили внутрибрюшинно в обьеме 0,1 мл суспензии клеток на физрастворе, Кровь дляполучения сывороток отбирали из хвоста животных.Контрольная группа животных - 6 самок С 57 В 1/6 из той же партии, что и опытная, была иммунизирована 11 раз внутрибрюшинно (табл. 1). Подобная схема являетсятрадиционно используемой в серологии НУ-антител.Эмбрионы 3,5-дневного возраста от мышей линии Сй были аттестованы с использованием эитисыворотки, полученной внутриселезеночиой иммунизацией с последующими двумя реиммуниэациями (реагент М 1) и антмсыворотки, полученной после внутрибрюшинных иммунизаций (ре агент ФЗ).Аттестацию эмбрионов на Н-У и Н-Уосуществляли нэ микроскопе МБИУ с помощью непрямого иммунофлуоресцентного метода, где в качестве первых антител ис пользовали полученные антисыворотки.Продолжительность инкубации в Н-У-анти- телах составляла 40-45 мин, затем отмытые эмбрионы помещали в 10-ный ФИТЦ- конъюгат иммуноглобулинов на 20 - 30 мин.30 Поглощение ФИТЦ при длине волны 495ммк, опускание желто-зеленого цвета при длине 510 мкм.Эмбрионы, иммуногенетически определенные как одного пола (Н-У - предполага емые самцы, Н-У - самки), пересаживали по3-8 шт. в правый рог матки реципиентов, левый рог служил контролем.Определение морфологического поларазвившихся эмбрионов осуществляли на 40 14 день беременности самки. К этому срокугонады плодов имеют значительные морфологические различия, и они были идентифицированы по морфологическому полу со 100 Д-ной точностью. Одновременно реги стрировали и число резорбций (табло. 2).Из данных, приведенных в табл. 2, видно, что при примерно одинаковом уровне приживляемости эмбрионов (26,7-23,3 0 ь), при использовании антисывороток М 1, М 3 50 и в контроле существенные различия выявляютсд в уровне резорбции пересаженных эмбрионов. Общее число резорбций в контроле выше. Это свидетельствует о том, что при определении пола эмбрионы, потенци ально не способные к развитию, элиминируются. Это свойство в большей степени характерно для антисыворотки, полученной методом внутриселезеночной иммунизации.2001627 Таблица 1 Схема иммунизаций инбредных мышей-самок С 57 В 1/6 для получения Н-У-антисывороток,используемых для определения пола эмбрионовОтбор крови на антисыворотку Число животных+ Н-У эмбри- онов Способ иммунизации и дата ее проведения1:16 133:123 Таким образом, использование Н-У-антисыворотки, полученной при внутриселеэеночной иммунизации с последующей реиммнизацией клетками селезенки (35- 40 10 клеток) сингенного самца, гарантирует определение пола у эмбрионов с точностью 77-80 , снижает число реэорбций пересаженных эмбрионов.При использовании контрольной анти- сыворотки (В 3), полученной известным методом - внутрибрюшин ными иммунизациями, были получены схожие результатыы - 75-80 -ная точность определения пола 3,5-дневных эмбрионов-бластоцист. Однако ее получение потребовало больше времени, сама схема является относительно трудоемкой. 1. Внутриселезеночный - 2.03,89 Реиммунизация внутрибрюшиннаяклетками селезенки - 22,03,89в дозе 35-40 10 (0,1 мм) Реиммунизация внутрибрюшиннаяклетками селезенки - 10.04,89в дозе 35 - 40 10 (0,1 мл) 2, Все иммунизации внутрибрюшинные, доза антигена 35 - 40 10 (0,1мл) клетками селезенки27.02.89 5.05,892.03.89 11.05.896,03.89 16.05.899.63,69 19,05.8913.03.89 22,05,8910,04.89 Затраты времени и труда в этом случае более чем в 2,5-3 раза превышают аналогич- .ные показатели предлагаемой схемы получения Н-У-антисывороток.5 Способ применим в практике определения пола пересаживаемых эмбрионов всех аидов млекопитающих, прежде всего эмбрионов крупного рогатого скота и овец. На основе применения предлагаемого способа 10 могут быть созданы банки замороженныхэмбрионов с идентифицированным полом,(56) 1. Патент США М 4511661,кл. 6 01 й 33/54, 33/58. С 12 й 15/00, 1983.152. ), й. РебгаЫта, 6. В. Апбегвоп.,),йергоб. ГепИ., 74, 1985, с, 637-644.10 2001627 Таблица 2 Влияние способа получения Н-У-антисывороток, используемых для определения пола эмбрионов, на точность определения и уровень резорбций эмбрионов после пересадки4/16 5/15 20 (24,39) 20 (20.62) 16/8 19/8 82/42 97/41 80,0 75,0 35 (9,3) 57/44 66/34 378/189 101 (26,7) 78,2 всем аггестован ным эмбрионам Контроль- ная 30/38 46 (15,8) 292/127 68 (23,3) 48/20 г ппа-3 реципиента, которым были пересажены мужские эмбрионы. выбыли из опыта послехирургической пересадки,Формула изобретения СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Н-У-АНТИСЫВОРОТКИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛА 5 ПРИ ПЕРЕСАДКЕ ЭМБРИОНОВ, включающий введение антигена, отбор сыворотки, постановку тестов на обнаружение Н-У-антигена, отличающийся тем, что в качестве10 Составитель И. АгафоноваТехред М.Моргентал Корректор М, Самборская Редактор Л, Павлова Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Заказ 3140 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Н-У (определенц как самки) Н-У+ (определены как самцы) Итого по Перенесено эмбрионов беремен- ных антигена используют частицы кожи сингенного самца, введение осуществляют однофаэово внутриселезеночным способом, а затем дополнительно проводят одно- или двукратно внутрибрюшинную реиммунизацию клетками селезенки сингенного сам- ца