Реактив для определения формиата или соединений, переходящих в формиат

Союз Советских Социалистических РеспубликОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ пц 860718(23) Приоритет - (32) 18. 03. 77 С 01 М 33/54 Государственный комитет СССР но делам изобретений и открытий(72) Авторы Иностранцы изобретения Герхард Михаль, Рольф,лаубе ер"(54) РЕАКТИВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОР ИЛИ СОЕДИНЕНИЙ, ПЕРЕХОДЯЩИХ В ТАРМИА тельно содержит форми зу из Сапд 10 а Ьо 161 п 1 индинуклеитид лития, мононатрийфосфат при отношении компонентов атдегидрогенаникотинаден-инатрийфосфат,и следующем совес,е: ропс 1 1 д ормиатдегиденаза из Со 101 п 11икотинаденинуклеотидинатрийфосононатрийфода,001-0 нлитатсфа 0,007-0,7 0,153-3,1 0,01-0,2 Остальное 1А; Получение ф П 20 для опред нений, пе ется такж Цель и эффективн Постав тем, что миата или формиат, уют с пФеоа с Изобретение относится к акалческой химии, а именно к состадля определения формиата или снений, переходящих в формиат.Известен реактив для определенияформиата или соединений, переходящихв формиат, на водной основе, содержащий аденозинтрифосфат и тетрагидрофолиевую кислоту 1 .Недостатком указанного реактиваявляется его низкая эффективность.Наиболее близким к изобретениюпо технической сущности и достигаемому результату является реактив дляопределения формиата или соединений, 15переходящих в формиат, на водной основе, включающий аденозинтрифосфат,триэтаноламин, хлорид магния, ацетатнатрия, гидроокись калия и тетрагидрофолиевую кислоту 21.Недостатком известного реактиваеления формиата или соедиреходящих в формиат, являе его низкая эффективность.зобретения - повышениеости реактива,ленная цель достигаетсяреактив для определения форсоединений, переходящих вна водной основе, дополни мента.400 г Сапд 1 да Ьо 1 дп 11, культивируемого на метаноле, в глубокозамороженнбм состоянии размораживают в 1200 мл 50,ц М раствора аммонсульфата и держат в нем 1 ч при 37 С. Поо том рН суспензии устанавливают с помощью 10-ного раствора полиэтилен- амина на значении 7,5, Осадок центРифугируют, выдерживают в 9-ном по объемурастворе фосфатгеля с рН 7,5 и спустя 30 мин центрифугируют. После промывания 0,5 М раствором МаС 1 гель экстрагир омощью 0,2 М фосфатного бчарН 7, 5. Экстракт помещают н 3, 2 Мраствор аммонсульфата, причем рНподдерживается равным 7,5. Образованный осадок отделяют и после растворения в Фосфатном буфере (рН 7,5)хроматографируют через ДЕАЕ-целлюлозу (целлюлоза, модифицированнаясоединением диэтиламиноэтанола),причем,элюирование осуществляют сувеличением концентрации буфера фосфата с рН 7,5. Содержание ФДГ фракции объединяют, вновь вносят на3,2 М раствор аммонийсульфата, оставляя рН постоянным. Осадок отделяют,растворяют в фосфатном буфере срН 7,5 и после диализа обрабатываютгидроксилапатитом. После отделениягидроксилапатита раствор лиофилизируется.Выход 0,7 г лиофилизата со специфической активностью около 3,5/мгпротеина. Общий выход составляет 43.Б, Определение формиата.0,02 мл 0,100 М водного НАД-раствора, 0,02 мл 2,5,о М растнора формиата натрия и 0,8 мл 0,05 М фосфатбуфера с рН 7,5 перемешивают междусобой и доливают до 1,0 мл воды.В пробе, взятой для сравнения,раствор Формиата заменяется равнымколичеством воды, Для обеих пробпри 366 нм измеряется начальная экстракция. После этого реакция продолжается за счет добавления 0,2 и ФДГ,Спустя 30 мин определяется конецэкстинции,Результат вычисляют .с величинойдля НАДН 3,4 смфМ по литературнымданным. В 6-ти параллельно проводимых опытах получается значениепри коэффициенте вариации 1,28.Таким образом, результат статически не должен отличаться от теоретически определенной величины.Определения в этих случаях проводят следующим образом.П р и м е р 2. Определение оксалата,А, Оксалатадекарбоксилазу изСо 11 уЬа 1 ц 1 рез растворяют в 1 мл0,2 моль/л и цитратного буферного раствора с рН 4,0 фК 0,07 мл этогораствора смешивают я 0,1 мл раствора пробы оксалата 0,5 ммоль/л и30 мин выдерживают при комнатнойтемпературе. Затем к пробе оксалатаприбавляют 0,8 мл реактива из примера 1. После смешения замеряют экстинкцию при 366 нм и прибавляют Формиатдегидрогеназу. После 30 мин выдерживания при комнатной температуреснова измеряют экстйнкцию.Результаты рассчитывают по лите,ратурным данным для НАдН с=3,4 см /ммоль,99,4 взятой величины),В трех параллельных опытах йолучают 0,0497 ммоль (99,4 взятой величины),0,01 мл 0,010 м/л водного НАДрастнора, 0,02 мл 2,5 ммоль/л раствора натрийформиата и 0,1 мл0,05 моль/л Фосфатного буферногораствора с рН 7,5 смешивают и доливают до 1,0 мл воды,В сравнительной пробе растворФормиата заменяется одинаковым количеством воды. Для обеих проб измеряется затем начальная экстинкция при 36,366 нм. В результате добавки 0 04 ед.ФДК начинается рсакция. Через 50 минсчитывается конечная экстинкция.Результат рассчитывают с литературной величиной для НАДН33,4 см / моль, При 6 параллельных 5 опытах получается 0,0502 мол =:100,3 введенной неличиньР прР вариационном коэффициенте 1,29Б, Верхний предел26ИаНР 04 12 Н 0 30,59 3,059йаНйРОНдО 2,02 0,202НАД.2 ЙР О 7, 05 0,705ФДГ 1,43 0,143Н О Остальное Остальное 250,01 мл 0,01 моль/л водного НАДраствора, 0,02 мл 2,5 моль/л раствора натрийформиата и 0,8 мл0,125 моль/л Фосфатного буферногораствора с рН 7,5 смешинают и долиЭф нают до 1,0 мл воды,В сравнительной пробе растворФормиата заменяется одинаковым количеством ноды. Для обеих проб измеряется затем начальная экстинкция при 35 366 нм. Лотом начинается реакция врезультате добавки 5,0 ед. ФДГ. Через 10 мин считывается конечнаяэкстинкция.Результат рассчитывают с литеращ турной величиной для НАДН3,4 см/моль, При 6 параллельных опытах получается 0,0504 ммоль ( 100,7введенной величины при вариациоиномкоэффициенте 1,28). ИаНР 04 12 Н О 6,12 0,612НаНРО 4 НО 0,40 0,040НАДН 0 0,67 0,007ФДГ 1,43 0,143фф Н О 991,98 99,1980,01 мл 0,01 моль/л водного НАДраствора, 0,02 мл 2,5 моль/л раствора натрийформиата и 0,4 мл0,05 моль/л фосфатного буферногораствора смешивают и доливают до0,2 мл воды,В сравнительной пробе раствор Формиата заменяется одинаковым количеством ноды. Для обеих проб измеряетИ ся затем начальная экстинкция при366 нм. В результате добавки 5,0 ед,ФДГ начинается реакция. Через 10 минсчитывается конечная экстинкция.Результат рассчитынают с литераб 5 турной величиной для НАДН860718 3,4 сМ /,цмоль. При 6-ти параллель 2но проводимых опытах получается 0,0492 моль (98,3 введенной величинй при вариационном коэффициен.те 1,31). г. мгйаНР 04 12 НО 24,48 2,448 й.аНР 04Н 0 1, 611 0,161 НАД.12 Н О 7, 05 0,705 ФДГ0,056 О, 006П р и м е р 3. Определение эфирамуравьиной кислоты.1 ммоль эфирамуравьиной кислоты нагревают в водном растворе с 1,3 моль йаОН до тех пор, пока не перестанет изменяться величина рНЗатем рН реакционного раствора устанавливают на 7,5 фосфорной кислотой, добавкой воды снижают концентрацию . образовавшегося формиата до2,0 ммоль/л, а затем, как и в предыдущем примере, проводят определение добавкой реактива из примера 1.Пример 4.4 Нижний предел Формула изобретенияФормиатдегидрогеназа из СапддаЬо 101 п 11Никотинадениндинуклеотид лития Динатрийфосфат Мононатрийфосфат Вода О, 001-0,1 30 0,007-0,7 0,153-3,1 0,01-0,20 Остальное 0,10 0,010 0,007 35 0,001 Осталь- ное,;.0,1 мл 0,10 моль/л водного НАД- раствора, 0,02 мл 2,5 моль/л раствора натрийформиата и 0,8 мл0,10 моль/л фосфатного буферного раствора с рН 7,5 смешивают и доливают до 1,0 мл воды,Составитель Л. СоломенцеваТехред Т,Маточка Корректор Н,Швцдкая Редактор М.Митровка Заказ 7598/32 Тираж 907 Подписное ВНИИПИ ГосударСтвенного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5(никотинодениндинуклеотид) 0,07 Формиатдегидрогеназа (ФДГ) .0,01Н.О Осталь- ное В сравнительной пробе раствор фор.миата заменяется одинаковым количеством воды. Для обеих проб измеряетсязатем начальная экстинкция при366 нм. В результате добавки 0,2 ед.5 ФДГ начинается реакция Через 30 минсчитывается конечная экстинкция.Результат рассчитывают с литературной величиной для НАДН3,4 см /О моль. При б параллельныхопытах получается 0,0494 моль (98,7введенной величины при вариационномкоэфФициенте,2,3). Реактив для определения формиатаили соединений, переходящих в Формиат, на водной основе, о т л ич а ю щ и й ся тем, что, с целью 20 повьзаения эффективности реактива,он лополнительно содержит формиатдегидрогеназу э Сапд 1 да Ьо 1 Ь 1 п 11 никотинадениндинуклеотид лития, динатрийфосфат имононатрийфосфат при р 5 следукщем соотношении компонентов,вес.: Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Вегдееуег Н.О, МесЬодеп бегепяувай 1 всйеп Апа 1 узе, 3. АпГ 1 аде,Вапд 11, 1974 з 1591-1596. 2. Вегдщеуег Н,О. ИеЬоОеп дег еплуаас 1 асЬеп Апа 1 уае, 3. АпГаде, Вапд 11, 1974, а 1591-1596 (прототип).