Способ определения скорости метаболизма акрилатов в микросомальном препарате

) 5 6 01 й 33/5 СУДАРСТВЕННЫЙ ИЗОБРЕТЕНИЯМИ ГКНТ СССР МИТЕТОТКРЫТИЯМ ЕТЕНИЯ ОРСКОМУ С ТЕЛЬСТВ К ытников и м обсомь редин- юшную ИСАНИЕ ИЗО(71) Красноярский государственный медицинский институт(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СКОРОСТИМЕТАБОЛИЗМААКРИЛАТОВ В МИКРОСОМАЛ Ъ НОМ П РЕПАРАТЕ(57) Изобретение относится к медицине иможет быть использовано в медицинскойксенобиохимии, токсикологии, профпатологии и патологической физиологии. Цель изобретения - повышение точности,Изобретение относится к медицине и может быть использовано в медицинской ксенобиохимии, в токсикологии, профпатологии и патологической физиологии.Целью изобретения является повышение точности, чувствительности и упрощение способа,Цель реализуется путем.инкубации при 37 С 5 - 30 мкм МА в инкубационной смеси, состоящей из 1,0 мл 0,05-0,200 М трис-НО буфера (рН 7 - 8,0), 0,5 мкм НАДФН, 5 мг/мл микросомального белка при времени инкубации, равном не менее 5 мин, и оценкой скорости метаболизма акрилата по уровню образования формальдегида (Ф).На чертеже дан график (кривые 1 и 2), поясняющий предлагаемый способ..Я 2 17 ОО 475 А 1 чувствительности и упрощение способа, Цель достигается путем инкубации 5 - 30 мкм метакрилатов в инкубационной среде, состоящей из 1,0 мл 0,05 - 0,200 М трис НС буфера (р Н 7-8,0), 0,5 мкм НАДФ Н, 5 мг/ л микросомального белка. Инкубацию пр.водят не менее 5 мин при 37 С, затем реакцию останавливают ТХУ, отделяют супернатэнт, добавляют к нему 2 мл раствора реагента, содержащего 0,004 мл ацетилацетона, 0,006 мл ледяной уксусной кислоты и 0,3 г уксусно-кислого аммония, продукт реакции измеряют при 412 нм с последующим расчетом количества образовавшегося формальдегида. Способ обладает в 6 раз большей чувствительностью по сравнению с прототипом и значительно сокращает время проведения массовых анализов. 1 ил., 8 табл. Способ осуществляется следуазом. По способу используют мик (МК), полученные из печени крыс,У забитых животных методом ной лапаротомии вскрывают бр стенку и перфузируют при 4 С печ твором 50 мМ трис-НС (рН 7,4), с щим 1,15;4 КС и 0,5 мМ ЗДТА. измельчают ножницами, смешива твором перфузата в соотношении : 3 мл перфузата, Гомогенат печени фугируют при 17000 9 на протяж мин, после чего берут надосадочн кость, разводят 50-ным растворо конечной 50-ной концентрации ПЭ трифугируют 10 мин при 18 000 ень рас- одержаПечень ют с расг ткани центриение 10 ую жидм ПЭГдоГ и ценоб/мин, 1700475ЛЕ1,251000 1,5 Б Т Л Е = Е- Ео,Определение микросомального белка проводят методом Лоури, Общее содержание цитохрома Р-.450 определяют по СО-пику в дифференциальном спектре восстановленного гемопротеида методом Оврага Т., Зато Я. Определение генерации Ф проводят при инкубации 5,30 и 180 мМ МА с 5-12 мг/мл белка микросом печени крыс в инкубационной смеси объемом 1,0 мл, состоящей из 0,05 - 0,200 М трис-НС буфера (рН 7,0-8,0), 0,5 мМ НАДФН, Инкубацию проводят при 20, 37, 45 С на протяжении 5, 15, 45 мин. Реакцию останавливают добавлением 20 ТХУ в количестве 0,25 мл на 1 мл инкубационной среды. Содержание Ф определяют в пробах до и после инкубации акрилатов с помощью цветной реакции с реактивом НАШЕ по известному методу, суть которого заключается в осаждении белка центрифугированием при 7 000 об/мин на протяжении 10 мин. К 0,5 мл полученного супернатанта добавляют 2,0 мл раствора НАШЕ, после чего проводят инкубацию в водяной бане при 37 С на протяжение.45 мин. Измерение оптической плотности окраски по ОД проводят на СФпри длине волны 412 нм. Подсчет Ф проводят, исходя из коэффициента малярной экстинкции, равного 1,5 см мМ . При этом из показаний ОД опытов вычитается ОД фона, равная экстинкции образца перед проведением их инкубации, Скорость метаболизма акрилата рассчитывается по формуле где Т - время инкубации, мин;Б - белок, мгмл в пробе; 1,5 - коэффициент молярной экстинкции Ф, равный 1,5 см мМ (умножением на 1000, переводим скорость образования Ф из микромоль в наномоль);1,25 - разведение 1 мл инкубационной среды добавкой 0,25 мл 20)-ного раствора ТХУ; где Е - оптическая плотность, полученная при инкубации за время 5, 15, 45 мин;Ео - оптическая плотность смеси при времени инкубации 0 мин.Пример расчета скорости метаболизма метилакрилата в микросомальном препарате показан в табл.1,В процессе микросомального метаболизма из МА метилметакрилата (ММА) обра 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 зуется Ф (чертеж). Уровень его нарастает со временем инкубации, что видно иэ табл.2.Скорость метаболизма МА зависит от концентрации НАДФН в инкубационной смеси,Данные представлены в табл.З.Результаты показывают, что 0,5 мМ НАДФН является насыщающей концентрацией,Зависимость скорости окисления МА от молярности трис-НС буфера в инкубационной среде показана в табл.4.Изучение зависимости оценки метаболизма МА от рН инкубационной среды показывает, что интенсивность его генерации через 5, 15 и 45 мин в сериях опытов, имеющих рН 7-8,0, не отличается, При рН 8,5 уровень Ф через 5 мин был в 1,9-2,7 раз ниже, чем в сериях опытов с рН 7,5-8,0 (табл.5). Эти результаты показывают, что интенсивность образования Ф одна и та же при значениях рН 7 - 8,0.Скорость метаболизма МА зависит от рН инкубационной среды (табл.5),Изучение зависимости скорости метаболизма от температуры инкубационной среды показывает, что при температуре, равной 37 С, уровень Ф немного выше при 20 и 45 С, через 5 и 45 мин инкубации разница была 2-кратной с достоверностями (Р 0,001; Р 0,05) при инкубации на протяжении 15 мин ври 37 и 45 С по сравнению с аналогичной серией опытов при 20 С (табл,6).Эти результаты показывают, что метаболизм МА при температуре 37 и 45 С не отличается, Со снижением температуры до 20 С имеется резкое уменьшение скорости при 15 мин инкубации. Изучение зависимости скорости образования Ф от содержания белка, концентрации акрилата и времени инкубации представлено в табл.7. При нали-чии в инкубационной среде микросомального белка, равного 5 мг/мл, и 5 мМ концентрации МА содержание Ф через 15 мин инкубации выше, чем через 5 мин (Р 0,05), а через 45 мин выше, чем через 15 мин (Р 0,001). При этом же содержании белка, но концентрации акрилата, равной 30 мМ, отмечается та же закономерность: содержание Ф через 45 мин выше, чем через 15 и 5 мин инкубации (Р 0,01).Предложенный способ обладает в 6,6 раз более высокой чувствительностью и в 6 раз более высокой точностью по сравнению с прототипом и в 5 раз уменьшает затраты времени на проведение анализов. Достижение положительного эффекта предложенного способа по сравнению с прототипом представлено в табл,8.Таблица 1 р и м е ч а н и е, Инкубационная смесь состоит из 0,1 М трис-НО буфера (рН 7,5), 1 мМАДФН, 30 мМ МА и 12 мг/мл микросомального белка печени контрольных крыс,По предлагаемому способу использовалась смесь объемом 1,0 мл, 0,1 М трис-НС 3 буфера, рН 7,4, содержащая белка 5 или 12 мг; белка микросом печени 5 или 30 мкм, метилметакрилата, суспендированного в 0,83;6-ном тритоне. Инкубация проводилась при 37 С на протяжение 45 мин при постоянном встряхивании. По известному способу использовалась смесь объемом 3,0 мл, состоящая из 0,26 мМ бикарбонатного буфера, рН 7,4; 33 мг белка микросом печени, 90 мкм метилакрилата, суспендированного в 0,83 ф -ном тритоне. Инкубация проводилась при 37 С на протяжении 20 мин при постоянном встряхивании. По предлагаемому способу измерялся формальдегид, а по известному - акриловая кислота.Формула изобретения Способ определения скорости метаболизма акрилатов в микросомальном препарате путем инкубации акрилатов в присутствии реагента, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности, чувствительности и упрощения способа, инкубационная смесь дополнительно содержит НАДФН в насыщающей концентрации, инкубацию проводят не менее 5 мин при 37 С,затем реакцию останавливают ТХУ, отделяют супернатант, добавляют к нему 2 мл раствора реагента, содержащего 0,004 мл ацетилацетона, 0,006 мл ледяной уксусной 5 кислоты и 0,3 г уксусно-кислого аммония,измеряют продукт реакции при -"2 нм, а количество образовавшегося формальдегида (наномольмиллиграмм белка за время инкубации, минута) рассчитывают по фор муле 15 где Т - время инкубации, мин;Б - белок, мг/мл в пробе;1,5 - коэффициент молярной экстинкции формальдегида, равный 1,5 см мМ1,25 - разведение 1 мл инкубационной 20 среды за счет добавки 0,25 мл 20-ногораствора ТХУ;ЛЕ.= Е 1- Еогде Е - оптическая плотность, измереннаяпосле инкубации в течение 5, 15, 45 мин;25 Е - оптическая плотность при времениинкубации 0 мин,1700475 Таблица 2 Таблица 3 П р и м е ч а н и е. Инкубационная смесь трис-НС буфера содержит (рН 7,5) 5 мМ МоС 12;0,5 мМ,ЭДТА, 1 мМ НАФДН, 5 мг микросомального белка контрольных крыс на 1 мл инкубационной смеси. Опыты проведены на пуле микросом, объединенных от трех животных. аблиц При мМ ЭДТА Каждый о ч а н и е, Инкубационная смесь состоит из 0,1 М трис-НО буфера, рН 7,5; 0,5мг микросомального белка контрольных крыс на 1 мл инкубационной смеси.проведен на пуле микросом, обьединенных от трех животных.1700475 10 Таблица 6 Таблица 7 П р и м е ч а н и е, Инкубационная смесь состоит из 0,1 М трис-НС (рН 7,5),0,5 мМ НАДФН, 5 - 180 мМ МА, 5 - 12,0 мг микросомальчого белка контрольных крыс на 1 мл инкубационной смеси. Таблица 87700475 Ю Ь оставитель Т, Малютинаехред М Моргентал едактор Л. Гратилло глаксимишин ре Заказ 4464 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 и ГКНТ СС оизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101