Способ получения полисахарида

(51) С 08 В 37 00 Тв ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ И(71) Курский государственный медицинский институт(56) Авторское свидетельство СССРВ 861354, кл. С 08 В 37/6, 1978,(54) СПОСОБ ПОИУЧЕИИЯ ПОЛИСАХАРИДА(57) Изобретение относится к химии итехнологии высокомолекулярных соединений, в частности к получению водорастворимого полисахарида из соцвети. Изобретение относится к химии и технологии высокомолекулярных соединений, в частности к получению водо- растворимого полисахарида из соцветий липы сердцевидной.Цель изобретения - получение полисахарида, обладающего противогипоксической и антикоагулянтной активностью.П р и м е р 1. Выделение полисахарида проводят из фармакопейного растительного сырья (ГФ Х, цветки липы сердцевидной).Очистка сырья. Для удаления сопутствующих белков цветки липы сердцевидной обрабатывают 10%-ным раствором хлористого аммония (1(20) при рН 58- 6 в течение 6 ч. Шрот отделяют от жидкости фильтрованием. Для удаления ниэкомолекулярных примесей, в том числе и неорганическиХ, шрот обрабатывают 5%-ным раствором диэтилового эфира в этаноле (1:50) и взбалтывают липы сердцевидной. Изобре ляет получить полисахарид противогипоксической и ан ной активностью за счет тог тия липы сердцевидной обра чала 107-ным водным раство того аммония при модуле 2 6,0 и затем 5%-ным раство вого эфира в этаноле при с последующей сушкой при проводят экстракцию водой модуле 30, выделяют целев концентрированием экстрак кой двойным объемом этило при 5 С. 9 табл. тение позвообладающий тикоагчлянто, что соцвебатывают снаром хлорис и рП 5 8- ром диэтиломодуле 5 35-4б С,при 80 С и ой продукт та и обработ вого спирта 2 ч. Затем отфильтровывают. Остатокповторно обрабатывают новой порциейраствора той же концентрации. Процессочистки проводят при комнатной температуре и энергичном перемешивании.Остаток сушат при 35-40 С до воздушно-сухого сырья,Экстракция. Очищенное сырье заливают горячей водой (1:30) при 800в течение 2 ч. Затем отфильтровываютчерез двойной слой марли. Дополнительно фильтруют через двойной слойбумаги под вакуумом. Экстракт упаривают в вакууме над РО (остаточноедавление 10-15 мм рт.ст., температура35-40 С) до 1/20 первоначального объема, Сгущенный экстракт охлаждают доф,+3 С и медленно приэнергичном перемешивании прибавляют двойной объем96%-ыого этанола, подкисленного соляной кислотой (на 1 л 96%-ного этанола10 мл соляной кислоты), Оставляют40 на 60 мин, Затем осадок отделявт от жидкости при центригугировании. Промывают 60 и 96-ннм этанолом и диспергируют в ацетоне.Выделенный полисахарид условно назван гликуроногликан.Выход 11,51 от веса воздушно-сухого сырьяЗольность 1,5 И. Полученный продукт может быть дополнительно очищен от белковых примесей. 1 Х-ные растворы полисахарида обрабатывают смесьв хлороАорма и амилового спирта (в соотношении 3:1), встряхивают 25 ч. Затем центрийугируют. Водный слой повторно обрабатывают смесьв амилового спирта с хлороформом. Операции по повторяют до отрицательной реакции водного слоя с 20/-ной сульйосалициловой кислотой. Раствор (водный слой) 20 упаривают в вакууме и выделяют полисахарид, как описано вымя. Сушат во вакууме над РО при 35" 40 С (остаточное давление 10-15 мм рт.ст.) в течение 10 ч, Выход 95%, зольность 25 0,6-0,8%.П р и м е р 2. Биологическую активность гликуроногликана оценивают;,а) антигипоксическув активность - на трех моделях гипоксической гипоксии 30 (табл.1,2,3);б) антикоагулянтнув активность- по данным гемокоагулограмм (табл.4),",в) острую токсичность - по тесту летальных доз (табл.5).Препаратом сравнения служит мукополисахарид - гепарин. В качестве контроля используют аналогичные объе" иы изотонического раствора хлорида натрия.Противогипоксическув активность гликуроногликана, вводимого внутрибрюшинно белым мьпнам массой 20+2 г объемом 1 не превышающим 1,0 мл (90 опытов), оценивают по времени45 сохранения биоэлектрической активности сердца (ЭКГ) и наличию дыхательных движений у животных.Гипоксическую гипоксию моделируют при температуре окружающей среды (18-210 С) путемф а) абтурация трахеи; б) снижение рО во вдыхаемом воздухе барокамеры; в) пребывание в гермокамере.Абтурацию трахеи производят путем ,оигирования, исключая возможность55 захвата нервных стволов лигатурой. Время выживания животных в состоянии гипоксии (асфиксии) определяют по длительности сохранения биоэлектрической активности сердца, т.е. даннымэлектрокардиограАии (ЭКГ).Снижение рО во вдыхаемом воздухесоздают в барокамере при скоростиподъема на высоту 30 м/с. Результатыопытов, оцениваемые по тесту "смертельной площадки", представленыв табл.2.Антикоагулянтную активность гликуроногликана исследуют на б кроликахпороды 11 иншилла массой 2650 + 126 гпри помощи серийного медицинскогогемокоагулограйа ГКГМ. Для чегораствор гликуроногликана в дозе13,38 мг/кг и объеме 3 мл медленновводят в краевую ванну уха кролика.Кровь для исследования (0,1 мл) берутиз второго уха животного. Гемокоагулограмму записывают через 5, 2, 24 и48 ч после введения гликуроногликана,В качестве контроля используют изотонический раствор натрия хлорида.Данные гемокоагулограммы обработаны статистически и представлены втабл,4,Острую токсичность гликуроногликана исследуют в опытах на 7 Р белыхмышах массой 20 + 2 г по тесту летальной дозы (3 Щ) при внутрибрвшинномвведении в дозах 50, 100, 150, 200,250, 500, 750 и 1000 мг/кг в объемахдо 1 мл. Препаратом сравнения служилгепарин, вводимый в эквимолекулярныхдозах. Контрольным животным вводилианалогичные объемы иэотоническогораствора натрия хлорида. Летальностьопределяли через 24 ч после инъекциивеществ.,Результаты экспериментов представлены в табл.5,Антигипоксическая активность гликуроногликана представлена в табл.1,2, 3 (индексом "х" отмечены результаты, достоверно отличающиеся от контрольных, "у" - то же, от соответствующей дозы препарата сравнения приР (0,05).Антикоагулянтная активность гликуроногчтикана отражена в табл.4,Показатели, характеризующие оструютоксичность гликуроногликана, представлены в табл.5.Данные по противогипоксическойи антикоагулянтной активности полисахарида (А), полученного предложенным способом из соцветий липы сердцевидной и полисахариды (Б), получен5 1684287ного иэ соцветий липы сердцевиднойпо известному способу сведены втабл.5, 6, 7, 8 и 9,В табл,6-9 индексом "х" отмеченырезультаты, достоверно отличающиеся5от исходных; "у" - то же, от контроляпри РС 0,05; М - среднестатическиепоказатели; ш - среднестатическиеотклонения от И. Т а б л и ц а 1 Влияние гликуроногликана и гепарина на времясохранения биоэлектрической активностисердца при абтурации трахеи у мышей (И 1 л) оэа, мг/кг Время сохранения био электрической активности сердца, мин Вещество 12,38 ф 1,ОЬ О 13,55:Е 0,20 ф 8,40+ 1,21 9,24 0,41 7,4 Ь+ 0,25 6,69 13,38 1,65 3,30 Гликуроногликан Гликуроногликан Гепарин Гепарин Контроль Т а б л и ц а 2 Влияние гликуроногликана и гепарина навыживаемость мышей по тесту "смертельнойплощадки" (И+ я) за, мг/кг Время выкивания,мин Вещество 6,69 13,38 1,65 3,30 11,17+ 0,38 ф18,280,43"36,28+ 1,286,46+ 0,195,43+ 0,22 Гликуроногликан Гликуроногликан Гепарин Гепарин Контроль Формула изобретения Способ получения полисахарида экстракцией растительного сырья с последующим выделением целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью получения полисакарида,обладающего противогипоксической иантикоагулянтной активностью, вкачестве исходного сырья используютсоцветия липы сердцевидной, передэкстракцией растительное сырье дополнительно обрабатывают сначала 10 Х-нымводным раствором хлористого аммонияпри модуле 20 и рН 5,8-6,0, а затем57-ным раствором диэтилового эФира вэтаноле при молуле 50 с последующейсушкой при 35-40 С, экстракцию проводят водой при 80 С и модуле 30, а 15 выделение - концентрированием экстракта и обработкой двойным объемомэтилового спирта при 5 С.1684287 Т а б л и ц а 3 Влияние гликуроногликана и гепарина на выживаемость мьжей при гипоксии в гермокамере (Мгп) Доза, мг/кг Время выживания, мин Бе)цество Г 38,45+ 0,56 39,19+ 0,42 30,23 й 1,18 32,221,16 28,37 + 0,34 6,69 13,38 1,65 3,30 Гликуроногликан Гликуроногликан Гепарин Гепарин Контроль Таблица 4 Влияние глнкуроногликана (а) и гепарина (б) в сравнениис контролем (в) на показатели свертываемости кровипо данным гемокоагулограммы Ог щ) Показатели Исходные данные Динамика показателей гемокоагулограммы через 5 мин К,с Т ус Б,сек п 1 а мм Е П р и м е ч а н и еф г - время тромбиновой активности; К - времяобразования сгустка; С - константа коагуляции; Б ", константа уплотнения;Т -,константа свертывания; ва - амплитуда эластичности сгустка;С - индекс коагуляции; Е - эластичность сгустка, индексом "х" отмечены результаты, достоверно отличащциеся от исходных; "у" - от контроля; "о" - от препарата сравнения (р 0 ( О, 05),а) 44 + 7б) 47 9в) 48+ 8а) 105+ 11б) 116 1- 12в) 1184 9а) 325 + 18б) 297 4 21в) 283+ 20а) 548+ 37б) 497. 33в) 449:+ 31а) 493 + 22б) 473+ 24в) 401;. 2а) 54,0:Е 4,0б) 49, 6:1,5, 0в) 45,7+ 0,9а) 1 66+0,38б) 1, 87.+О, 29в) 1, 84+0, 22а) 75, 3+7,8б) 77,537,3в) 79, 1+.5, 1 62 + 1682+ 13")46 79612156 ф 5 "108+ 7312+ 26332 17298 19467+ 24506+ 35452 ф 21420 19458 ф 162405 ф 1846,0+15337,4+ 3440,3+ 21,72+ 0, 311,25+0,241,72+0,362,04-6,750,7+8,967,5+7,4 77+10"234(- 9 о47+ 7152 + 14257+ 38110+ Я339- 29353(- 38276+ 19553+ ЗЗф589+ 20 х440+ 28484+ 29546+ 37397 4- 2246,7 (. 2,528,7 + 2,743,9+ 1,81,54+0,201,03 0, 121,84 ф 0,2459, 4+4,278,4+4,2 88+ 15 х50 + 1248(.Ь164+ 1999 ф 17103 + 1134 + 34284+ 23276"- 14596+ 75472+ 56432+ 19505+ 444 Ь 1+ 37385+ 1750,3+3,950, 1+4,345,6+2,81,60+0,361,65+0,231,89+0, 1979,8 фб 387,2+5,3 1443543 + 1045+ 8161 + 19108+ 16120+ 8252+ 24271 24297+ 16553+ 27485+ 43469+ 28394+ 55450+ ЗЬ4191 2550,5 г 2;752,3 ф 4,542,1+ 3,31,48+, 681,83+, бб1,68 ф 0,3965,1+6,289, 2+8,416842 Р 7 Т а б л и ц а 5 Острая токсичность гликуроногликана и гепарина при внутрибрюшинном введении белым мышам(Иф ш) Вещество 11 оказатель летальности, мг/кг 1 Т ЛЛ 6 11Гликуроногликан Наг Нет НетГепарин 122,3(74,5 + 170,2) 54,3 190,3 Т а б л и д а 6 Влияние полисахаридов А и Б на время сохранения биоэлектрической активности сердца при абтрубации трахеи у мышей (11 Фш) Вещество Доза, мг/кг Время сохранения биоэлектрической активности сердца,мин Таблица 7 Влияние полисахаридов А и Б на выживаемость мышей по тесту "смертельной площадки" (И 4 ш) Доза, мг(кг Время выживания, мин Вещество Т а б л и ц а 8Влияние полисахаридов А и Б на выживаемостьмышей при гипоксии в гермокамере (М+ и) Вещество Доза, мг/кг Время выживания, мин А А Б Б Контроль А А Б Б Контроль А А Б Б Контроль 6,6913, 38 6,6913,38 6,69 13,38 6,69 13,38168428 г Таблица 9 Влияние полисахаридов Л и Б в сравнении с контролем В на показатели. свертываемости крови по данным гемокоагулограммы (М+ шй Показатели Исходные данные Динамика показателей гемокоагулограммычерез, ч 2 24 48 К, с Т, с Б, с П р и м е ч а н. и е: г - время тромбиновой активности; К - времяобразования сгустка; С - константа коагуля-.ции; Т - константа свертывания; Я - константауплотнения; ща - амплитуда эластичностисгустка; С - индекс коагуляции; Е - эластичность сгустка,Составитель Т.Мартинская Редактор М.Келемеш ТехредМ.Дидьпс Корректор М.ШарошиЗаказ 3483 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 А) 44+ 7Б) 45+ 5В) 48+ 8А) 105+ 11Б) 112+ 8В) 118+ 9А) 3253- 18Б) 291+5В) 283+ 20А) 548+ 37Б) 453+ 28В) 4494. 31А) 493+ 22Б) 422+ 17В) 401+ 21А) 540 + 4,0Б) 48,3 + 1,6В) 45 ь 7: 0,9А) 1 ьбб + 0,38Б) 1,73+0,27В) 1,84 еОь 22А) 75 ьЗ:7 ь 89Б) 68 ь 8 йбь 14В) 79, 13+5, 12 6 ф 1645+ 946+ 795 е 12120 9108+ У312+ 26318 . 12298+ 17467 е 24467 ф 22432+ 21420+ 19418+ 16405+ 1846, 0+15,34 бь 9+4 ьЗ40,3+2 ь 11 ь 54+Оь 281, 710,211 ь 72+0, 3162,0+б, 765 ь 2 ебь 267 ь 5 е 7 ь 4 77+ 1 ОЧ52+ 447+ 7152+14 ь120 6110+ 8339+29322+17281+19552+32,9 сь491+ 18440+28484+ 29426+103972246,7 ф 2,447 ь 5+343 ь 9 Х 1 ь 81,54+Оь 201,68+Оь 191, 84+0, 2459,4+4,2"67,3+5,778 ь 4.4 ь 2 88+ 1552 е 448 е 6164+19 "118+ 3103 е 11341+ 34315 +15276+ 14596+ 75487+ 12432+ 19505+ 44452+ 133851750 ь 33 ь 949,8+5,245,6+2 ь 81 ь 744-О 121, 89 еОь 1968 ь 2+бь 768 ь 9 8,187,2+5,3 144+ ЗЛо 56+ 6 45+ 8 161 ф 19 105" 9 12 ОФ 8 252. 24 289+ 11 2974. 16 553+ 27 446+ 24 469+ 28 394+ 55 405+ 18 419+ 25 50, е 2, 7 45, Зе 4, 1 42,1+3, 31 ь 48+ Оь 68 1,70+0,25 1,68+0,39 65,1+6,2 66,3+7,6 89 ь 2 ф 8 ь 4