Способ получения растворимой -атфазы

СОКИ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 9) (11) 3 3 /5 с ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СС ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКР(71) Горьковский государственный медицинский институт им, С.М.Кирова(56) 1. (Веес. й. В., НцдЬагй Б.А., Ь 3.ппег. Р.Е., М 3.1 сйе 11 А.О., Мцпп Е.А. А з 1 вр 1 е ацй гарЫ.веЖой Егов Юе ргйагаС 1 оп оГ айепоз 1 пе 1 г 1 рйозрйа 1 азе Егов зцЬв 1 госЬопйг 1 а 1 рагг 1 с 1 е; В 1 осЬев.Ю. 1975, 148,3, с. 533- 537) .2. Ногз 1 вап Ь.Ь., Вас)сег Е. Раг 1 а 1 гезо 1 цЫоп оЕ Же епз 1 вез сайа 11 з 1 пд охМаИче рЬозрйогу 1 а 1 оп. Х 11, ХпВегаМоп Ье 11 ечееп в 11."поспопйг 1 а 1 Адепоз 1 пе Тг 1 рйозрйагазе апй ййе Рго 1 е 1 п дпМЬЫог. д. оГ В 1 о 1. СЬев, 1970, 245, 1336-1344.3. Щипакин В .Н ., Азарашвили Т.С ., . Фролова Е.П., Евтушенко И,В. Выделе- ление и очистка мембранной аденозинтрифосфатазы митохондрий печени. - . В кн.: Биофизика живой клетки. Мембраны. Пущино, 1974, т, 5, 12-24.(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРИМОЙ Нф-АТФАЗЫ путем освобокдения митохондрий от внешних мембран в гипотонической среде, воздействия ультразвуком,экстрагирования и очистки целевого продукта высаливанием сульфатом аммония,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью получения растворимой Нф -АТФазы с большей удельной активностью, клетки головного мозга очищают от миелина и синаптосом в градиенте плотности сахаровы 0,7) .1,2 и 1,5 М, обрабатываютхлороформом и ультразвуком двукратно по 4-.6 мин и затем однократно втечение 23-27 мин, а перед высаливанием сульфатом аммония проводят изоэлектрическую преципитацию, далее пробу иикубируют при 64 С, а це левой продукт повторно высаливают сульфатом аммония.60 Изобретение относится к биохимии и может использоваться для получения растворимой Н "АТфазы из митохондрий клеток головного мозга.Известен способ. получения растворимой Нф -АТФазы из митохондрий кле 5 ток сердца, включающий экстрагирование Нф-АТфазы хлороформом (1,Известен способ получения Н -АТфазы из митохондрий сердца путем разрушения их ультразвуком (2). Известен также способ получения растворимой Н-АТфазы путем освобож дения митохондрий от внешних мембРан в гипотонической среде, воздействия ультразвуком, экстрагирования и очистки целевого продукта высаливанием сульфатом аммония 3)Недостатком данного способа является то, что он не приводит к выделе нию Н -АТфазы в раствор из-за рядаособенностей ткани головного мозга, отличающих ее от других тканей животного организма.Цель изобретения - получение раст"- воримой Н -АТфазы из митохондрий гоФ25лонного мозга с большей удельной активностью.Указанная цель достигается тем,что согласно способу получения растворимой Н -АТфазы путем освобождения митохондрий от внешних мембран вгипотонической среде, гоздействия ультразвуком; экстрагировання иочистки целевого продукта высаливанием сульфатом а лония клетки голов ного мозга очищают от миелина и синаптосом в градиенте плотности сахарозы 0,7; 1,2 М и 1,5 М обрабатывают хлороформом и ультразнуком двукратно по 4-6 мин и затем однократно в течение 23-27 мин, а перед высаливанием сульфатом аммония проводят изоэлектрическую преципитацию, далее пробу инкубируют при 64 С, а целеВОй пРОдукт повтОРВО ВысалиВают суль 45 фатом аммония.Способ осуществляют следующим образом.Неочищенную фракцию митохондрий мозга очищают от миелина и синапто сом. Для этого суспензию неочищенных митохондрий центрифугируют в градиенте плотности сахарозы 0,7- 1,2- 1;5 М при концентрации белка 1520 мг/мл при 60000 д в течение120 мин. 55. Далее митохондрии освобождаютот внешних мембран. Для этого их суспендируют,в гипотонической среде(0,02 М трис-буфер, РН 7,5) нз рас- чета 20 мг белка/мп среды, выдерживают при 4 С 28-30 мин. Осадок суспендируют в растворе (0,9 М ЖаС 1 и 0,02 М трис-буфер, РН 7,5) из расчета 20 мг. белка/мл среды и центрифугируют при 6000 д в течение 10 мин. 65 Данную оперрцию повторяют еще один раз.Полученные препараты контролиру-ют на полному отделения внешних мемб ран методом электронной микроскопии, а также дифференциальной спектрофотометрией по исчезновению цитохромов С и ВОсадок суспендируют в среде (0,25 М сахароза, 10 мМ трис-буфер и 1 мМ ЭДТА, РН 7,5) . Суспензию полученных субмитохондриальных частиц(20-30 мг белка/мл) добавляют0,5-0,6 объема хлороформа и легкопомешивают в течение 3-4 мин. Затемсмесь центрифугируют при 10000 д втечение 10 мин,Осадок обезжиренных СМЧ суспендируют в среде (0,1 М сахароза, 10 ММ трис-буфер и 1 мМ ЭДТА, РН 7,5) до концентрации 18-20 мг белка/мп, Суспензию подвергают действию ультразвука на холоде в течение 4-6 мин при частоте 22 кГц и токе 40 и А на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДЧТ.Суспензию центрифугируют при 140000 д н течение 30 мин, Данную операцию проводят два раза .Полученные ультразвуковые СМЧ разВодят дО концентрации 18-20 мг белка/мп среды (0,1 М сахароза, 10 мМ трис-буфер и 1 мМ ЭДТА, РН 7,5) . Суспензию СМЧ подвергают действию ультразвука непрерывно в течение 23-27 мин при частоте 22 кГц и токе 40 ц А на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДНТ. Суспензию при этом не охлаждаютПосле обработки суспензию центрифугируют при 200-250 тыс. д в течение 30 мин при температуре 18-20.С. Супернатант (надосадочная жидкость) используют для дальнейшей очистки АТфазы,Первым этапом очистки является изоэлектрическая преципитация. Для этого у супернатанта доводят РН до 5,4 1 н. уксусной кислотой . Раствор центрифугируют в течение 3-5 мин при 18000 д и температуре 15-18 С. При этом общее время выдержки РН 5,4 не должно превышать 10 мин У супернатанта РН доводят до 6,8-7 ед. сухим трисом.На втором этапе очистки проводят высаливание сульфатом аммония. Для этого добавляют порошок сульфата аммония до концентрации 50 от насыщения, корректируя при этом рН трисом (6,8-7,0 ед. РН) . Раствор выдерживают на холоде (4 фС) в течение 30-35 мин а затем центрифугируют при 10000 д в течение 10 мин . Осадок растворяют в сре,пе (0,25 М сахароза, 0,001 М ЭДТА,0,03 М АТФ и 0,01 М трис-буфер, 0,4 объема хлороформа, перемешиваютРН 7,5). при 4 С в течение 3-4 мин, ЗатемТретий этап очистки - термичес- центрифугируют 10 мин при 10000 д. кая обработка препарата. Для этого Супернатант выбрасывают. Осадок испрепараты АТФазы помещают в баню пользуют для получения УСМЧ. Общий(72 фС), нагревают до 64"С и перено белок 198 мг, общая активностьсят в баню (64 С), где выдерживают 116,82 мкМ фоофора/мин, удельнаяв течение 4 мин. Затем раствор ох- активность 0,59 мкМ фосфора/мг беллаждают при комнатной температуре ка 1 мин. Для получения УСМЧ осадок до 37 С и центрифугируют при обезжиренных митохондрий разводят18000 д в течение 10 мин. Осадок 10 до концентрации 20 мг белка/мп среды выбрасывают, (0,1 М сахароза, 0,001.М ЭДТА иК супернатанту добавляют порошок 0,01 М тес-буфер, РН 7,5) и затем сульфата аммония до концентрации ,воздействуют ультразвуком (22 кГц, 50 от насыщения, корректируя при40 р А) в течение 4 мин на холоде, этом РН раствора сухим трисом на 15 при этом используют дезинтегратор Уровне 7,5 ед. РН. УЗДНТ. Суспензию центрифугируютПолученный очищенный раствор 60 мин при 140000 д и температуре Н -АТФазы можно хранить при 4 С, 0 4 С. Осадок снова подвергают дейдля увеличения выхода АТФазы про-ствию ультРазвука в течение 4 мин водят дополнительные операции: оса О центрифугируют 60 мин при 140000 д док после ультразвуковой обработки и темпеРатУРе 0-4 С. Осадок суспензаливают средой (0,1 М сахароза, дируют в исходной седе.0,001 М ЭДТА и 0,01 С трис-буфер, Для экстракции Н -АТФазы ультра- РН 7,5) и разводят до концентрацйи звуковые СМЧ разводят до концентра мг белка/мл, добавляют 0,5-0,6 25 ции 18-20 мг белка/мл среды (0,1 М объема хлороформа, интенсивно встря- сахаРоза, 0,001 М ЭДТА и 0,1 М трисхивая в течение 2-3 мин. Центрифуги- буфер, РН 7,5) . Затем сь спензию подруют 10 мин при 10000 д. Супернатант вергают действию ультразвука отсасывают, центрифугируют 30 мин (22 кГц 40 Н А) в течение 23 мин. при 200000 д и затем опять проводятПосле этого центрифугируют в теплеочистку фермента.30: ф(15-18 С) 30 мин при 200000-250000 д,П р и м е Р 1. (минимальные значе Супернатант используют для дальнейния параметров) . Митохондрии головно- шей очистки АТФазы. Осадок помещаютго мозга получают, например, по мето- в холодильник (-20 С) для дальнейшеду Фонье и шомодьи. Общий белокго получения феРмента. Общий белок 4800 мг, общая активность 1632 мкМ 35 16;23 мг, общая активность 69,78 мкм Фосфора/мин и удельная 0,34 мкМ Фос- фосфора/мин, удельная активность фора/мг мин. Фракцию митохондрий 4,3 мкМ фосфора/мг белка мин. мозга суспендируют в 0,7 М холодной Очистку АТФазы начинают с изоэлектсахарозе и разводят до концентрации РиЧеокой преципитации. У суперна-20 мг белка/мл, Затем проводят 40 танта доводят РН 5,4 уксусной кислоцентрифугирование в градиенте плот- той (1 н) . Раствор сразу же центриности сахароэы 0,7-1,2-1,5 М (РН 7,5) фуригуют 3-5 мин при 18000 д, осадок в угловом роторе при 60000 д в тече- выбРасывают. У.супернатанта доводят ние 2 ч. Осадок представляет собой РН до 6,8-7 сухим трисом (время эксобогащенную фракцию митохондрий. 45. позиции не больше 10 мин)Общий беОбщий белок 320,05 мг, общая лок 3,18 мг, общая активность активность 208,10 мкМ фосфора/мин и 1558 мкМ фосфора/мин, удельная акУдельна 0 518 мкМ фосфора/мг бел тивность 4,7 мкМ фосфора/мг балка мин, камин .ФЗатем митохондрии для,освобожде- К РаствоРУ фермента добавляют ния от внешних мембран суспендируют сульфат аммония до конечной концентв гипотонической среде (0,02 М трио- . рации 50 от насыщения, корректируя буфер,рН 7,5) из расчета 20.мг бел- при этом РН 7,0-7,5 трисом. Раствор ка/мл среды и выдерживают при 4 С в выдерживают 30 мин при температуре течение 30 мин, Затем раствор центри С, затем центрифугируют 10 мин Фугируют 30 мин при 10000 д. Осадок при 10000 д. Супернатант выбрасыва 55суспендируют в растворе соли (0,9 М ют, осадок растворяют в среде (0,25 М ИаС 1 и 0,02 М трис-буфер, РН 7,5) из сахароза, 0,001.М ЭДТА, 0,03 М АТФ и расчета 20 мг белка/мя среды и цент,001 Х трио-буфер, РН 7,5) до конрифугируют 10 мин при 6000 д. Эту центрации 0,5 мг белка/млРаствор процедуру проводят два раза. Общий 60 помещают в бабаню с температурой 72 С, белок 210 мг, общая активность " нагревают до 64 фС и быстро переносят 134,40 мкМ фосфора/мин, удельная ак- в баню с температурой 64 С, где вытивность 210 мкМ фосфора/мг мин. За- держивают в течение 4 мин. Общий бетем в суспенэии митохондрий, лишен- лок 1,84 мг, общая активность . ных наружной мембраны, добавляют 65 22,81 мкМ фосфора/мин, удельная ак 1070479тивность 12,48 мкМ фосфора/мг белкафмин.К супе 1 натанту добавляют сульфат аммония до концентрации 50 от насыщения, корректируя рН 7,0-7,5 трисом. Общая активность фермента 12,01 мкМ Фосфора/мин,удельная активность 11,7 мкМ фосфора/мг белка мин, общий белок 1,68 мг.Полученный белок обладает АТфазной активностью, устойчив к.олигоми цину и ингибируется циклометилкарбодинмидом (ЦМКД) .П р и м е р Р 2 (оптимальные значения параметров) . Получают митохондрии из головного мозга, напри мер, по методу Фонье и Шомодьи, Общий белок 5406 мг, общая активность ,1973 мкМ фосфора/мин, удельная актив. ность 0,365 мкМ фосфора/мг мин. Фракцию митохондрий мозга суспендируют 20 в 0,7 М холодной сахарове и разводят до концентрации 18-20 мг белка/мп. Затем проводят центрифугирование в градиентеплотности сахарозы 0,7 1,2- 1,5 М (рН 7,5) в угловом роторе при 25 60000 д в течение 2 ч. Осадок представляет собой обогащенную фракцию митохондрий. Общий белок 340,03 мг,общая активность 340,03 мкМ Фосфора/мин удельнаяактивность 0,613 мкМ Фосфора/мг белка мин.Затем митохондрии для освобождения от внешних мембран суспендируют в гипотонической среде (0,02 М трисбуфер, рН 7,5) из расчета 20 мг белка/мл среды и выдерживают при 4 С в течение 30 мин. Затем центрифугируют 30 мин при 10000 9. Осадок суспендируют в растворе соли (0,9 М ИаС 1 и 0,02 М .трис-буфер, рН 7,5) из расчета 20 мг белка/мл среды и 40 центрифугируют 10 мин при б тыс, Эту процедуру проводят два раза. Общий белок 243,96 мг, общая активность 170,16 мкМ фосфора/мин, удельная активность 0,712 мкМ Фосфора/мг 45 белка мин.Затем к суспензии митохондрий, лишенных наружной мембраны, добавля-. ют 0,5 объема хлороформа, перемешивают и выдерживают при 4 С в тече-. ние 3-4 мин. Затем центрифугируют 10 мин при 10000 д, Супернатант выбрасывают. Осадок используют для УСМЧ. Общий белок 210,81 мг общая активность 143,50 мкМ Фосфора/мин, удельная активность 0,681 мкМ фосФора/мг белка мин. Для получения УСМЧ осадок обезжиренных митохондрий разводят до концентрации 20 мг белка/мп среды (0,1 М сахароза, 60 0,001 М ЭДТА и 0,01 М трис-буфер, рН 7,5) и затем воздействуют ультразвуком (22 кГц, 40 у А) в течение 5 мин на холоде, при этом используют дезинтегратор УЗДНТ. Суспензию 65 центрифугируют 60 мин при 140000 у и температуре 0-4 С, Осадок снова подвергают действию ультразвука в течение 5 мин и центрифугируют 60 мин при 140000 д и температуре 0-4"С. Осадок суспендируют в исходной среде.1 РДля экстракции Н -АТфазы ультразвуковыеСМЧ разводят до концентрации белка 20 мг белка/мл среды (0,1 Исахароза, 0;001 М ЭДТА и 0,1 М трисбуфер, рН 7,5) . Затем суспЕнзию подвергают действию ультразвука. (22 кГц, 40 Ь А) в течение 25 мин, После этого,центрифугируют в тепле (15 18 С) 30 мин при 200000- 250000 д. Супернатант используют для дальнейшей очистки АТфазы. Осадок помещают в холодильник (-200 С) для дальнейшего получения Фермента, Общий белок 18,10 мг, общая активность 81,00 мкМ Фосфора/мин, удельная активность 4,50 мкИ фосфора/мг белкамин.Очистку АТФазы начинают с иэоэлект рической преципитации . У супернатанта доводят рН до 5,4 уксусной кислотой (1 н). Раствор сразу же центрифугируют 3-5 мин при 18000 у, осадок выбрасывают. У супернатанта доводят рН до 6,8-7 сухим трисом(время экспозиции рН 5,4 не больше 10 мин), Общий белок 4,31 мг, общая активность 23,26 мкМ фосфора/мг белка мин, удельная активность 4,7 мкМ фосфора/мг белка мин, К раствору фермента добавляют сульфат аммония до конечной концентрации 50 от насыщения, корректируя при этом рН 7,0-7,5 трисом. Раствор выдерживаЮт 30 мин при температуре 4 фС, затем центрифугируют 10 мин при 10000 д. Супернатант выбрасывают, осадок растворяют в среде (0,25 М сахароза, 0,001 М ЭДТА, 0,03 М АТФ и 0,001 М трис-буФер, рН 7,5) до концентрации 0,5 мг белка/мл, Раствор помещают в баню с температурой 72 С, нагревают до 64 С и быстро переносят в баню с температурой 64 С, где выдерживают в течение 4 мин, Общий белок 2,48 мг, общая активность 39,92 .мкИ. Фосфора/мин, удельная активность 16,12 мкМ Фосфора/мг белка мин. К супврнатанту добавляют сульфат аммония до концентрации 50 от насыщения, корректируя рН 7,0-7,5 трисом. Общая активность фермента 31,45 мкМ Фосфора/мин, удельная активность 16,01 мкМ Фосфора/мг белка мин, общий белок 1,92 мг,Полученный белок обладает АТфазной активностью, устойчив к олигомицину и ингибируется ЦМКД.П р и м е р 3 (максимальные значения параметров)Получают из голов-, ного мозга митохондрии, например, по методу Фонье и Шомодьи. Общий беЗаказ 11673/42 Тираж 823 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патент 1, г. ктна город, улс лок 5200 мг, общая активность1976 мкм фосфора/мин, удельная активность 0,38 мкМ фосфора/мг мин. Фракцию митохондрий мозга суспендируютв 0,7 М холодной сахарозе и разводятдо концентрации 18-20 мг белка/мл.ЗатеМ проводят центрифугирование вградиенте плотности сахарозы 0,7-1,21,5 М (РН 7,5) в угловом роторе при60000 д в течение 2 ч. Осадок представляет собой обогащенную фракцию 10митохондрий. Общий белок 331,0 мг,общая активность 173,77 мкм фосфо-.Ра/мин, удельная активность0,525 мкМ фосфора/мг белка мин,Затем митохондрии для освобождения 15от внешних мембран суспендируют вгипотонической среде (0,02 М трисбуфера, РН 7,5) из расчета 20 мгбелка/мл среды и выдерживают при 4 Св течение 30 .мин. Затем центрифугиру. 2ют 30 мин при 10000 у. Осадок суспендируют в растноре соли (0,9 М НаС 1и 0,02 М трис-буфер, РН 7,5) из расчета 20 мг белка/мл среды и центрифугируют 10 мин при 6000 д. Эту процедуру проводят два раза. Общий белок 224,0 мг, общая активность154,56 мкМ фосфора/мин, удельная активность 0,69 мкМ фосфора/мг белкафмин,Затем в суспензию митохондрий,лишенных наружной мембраны (концентрация 25-30 мг/мл) доб .аляют 0,5 объема хлороформа, осторожно перемешивают и выдерживают при 4 С в течение3-4 мин, затем це.трифугируют 10 минпри 10000 д. Супернатант выбрасывают. Осадок используют для полученияультразвуковых СМЧ. Общий белок201,0 мг, общая активность 122,61 мкМФосфора/мин, удельная активность 400,61 мкМ фосфора/мг мин. Для получения ультразвуковых СМЧ осадок обезжиренных митохондрий разводят до концентрации 20 мг белка/мл, среды(0,1 И сахароза, 0,001 М ЭДТА и 450,01 М трис-буфер, РН 7,5) и затемвоздействуют ультразвуком (22 кГц,4 ОаА) в течение б мин на холоде,используя при этом дезинтеграторУЗдНТ, Суслензию центрифугируют 5060 мин при 140000 д и температуре0-4 С. Осадок снова подвергают действию ультразвука в течение б мин ицентрифугируют 60 мин при 140000 9и температуре 0-4 С. Осадок суспен- . 55 дируют в исходной среде. Для экстракции Нф -АТФазы УСМЧ разводят для концентрации 20 мг белка/мл среды (0,1 Мсахароза, 0,001 М ЭДТА и 0,01 трио- обуФер, рй 7,5). Затем суспензию под-вергают действию ультразвука (22 кГц,40 РА) в течение 27 мин. После этогоцентрифугируют в тепле 15-18 С 30 минпри 200000-250000 д. Супернатант используют для дальнейшей очисткиАТФазы. Остаток помещают в холодильник (-20 С) для дальнейшего получения фермента. Общий белок супернатанта 19,21 мг, общая активность78,76 мкМ фосфора/мин, удельная ак-.тивность 4,2 мкМ фосфора/мг мин.Очистку АТФазы начинают с изоэлект.рической преципитации. У супернантадоводят РН до 5,4 уксусной кислотой(1 н). Раствор сразу же центрифугируют 3-5 мин при 18000 д, осадок выбрасывают. У супернатанта доводят РНдо 6,8-7 сухим трисом (время экспо.зиции РН 5, 4 не больше 10 мин) . Общий белок супернатанта 4,58 мг, об-,щая активность 21,52 мкМ фосфора/минудельная активность 4,58 мкМ фосфорагмг мин. К раствору фермента добавляют .сульфат аммония до конечной концент"рации 50 от насыщения, корректируяпри этом РН 7,0-7,5 сухим трисом.Раствор выдерживают 30 мин при температуре 4 фС, затем центрифугируют10 мин при 10000 фд. Супернатант выбрасывают, осадок растворяют в среде(0,25 М сахароза, 0,001,М ЭДТА,0,03 М АТФ и 0,001 трисбуфер, РН7,5) до .концентрации 0,5 мг белка/мь.Раствор помещают в баню с температурой 72 фС, нагревают до 64 С и быстропереносят в баню с температурой 64 С,где выдерживают в течение 4 мин.Общая активность фермента 12,01 мкМфосфора/мин, удельная активность7,8 мкМ фосфора/мг белка мин, общийбелок 1,5 мг. Полученный белок обладает АТФазной активностью, устойчив к олигомюцину и ингибируется ЦМКД.Предлагаемый способ позволяет выделять из митохондрий головного мозга растворимую Нф-АТФаэу с более высокой удельной активностью (12-18 мкМ фосфора/мг мин) по сравнению с известным способом (0,5 мкМ фосфора/мг мин).