Способ получения эндо-n-ацетилмурамидазы и комплекса лизирующих ферментов

)5 С 12 й 9/36, 1/20 ОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Институт микробиологиии Московская медицинскаяим, Сеченова(72) В. Д. Кузнецов, 3. Ф. Шма Н СССР кадемия Изобретение относится к биохимии и Целью настоящего изобретения являет ферментной промышленности, а именно."кся повышенйе выхода энда-й-ацетилмура- СО способу получения эндо-й-ацетилмурами- мидазы с одновременйым исключением из - а дазы и комплекса ферментов, лизирующйх питательной среды гидролиэата казеина я клетки бактерий, включая гемолитический фирмы ООсо.стрептококк группы А, Цель достигается тем, что продуцентНаиболее близким к предлагаемому яв- Я,ечог з выращивают глубинным способом ляется способ получения энда-Й-ацетилму- при температуре 26-28 в течение 56 - 70 рамидаэы и комплекса лизирующих. часов послеинокуляцийколб 2-суточнымвеферментов с использованием актиномицетагетатйвныммицелием в количестве 5 об. - д - продуцента - Ятпертоаусез )ечогз при на ферментационной среде, содержащей выращивании на ййтательной среде, содер- ф); кукурузный экстракт - 0,8 - 1,2 (по сырожащей гидролизат казеина фирмы ОНсо (1), му весу), натрий хлористый - 0,4 - 0,6; глюкоНедостатком данного способа является не- за - по 0,20,05 через каждые 20 - 24 часа высокий выход ферментов и использование ферментации; аммоний сернокислый - 0,3- в питательной среде дорогостоящего ком,4; мел технический - 0,4 - 0,5", крахмал карпонента - гидролизата казеина фирмы тофельный - 0,5-0,6, рН среды 7,4 - .7,8 00 со, приобретаемого за валюту,(доводится 0,1 й МаОН), При этом достигакова и Н, И. Брико(56) Шмакова 3. Ф. и др. Литические ферменты, продуцируемые Аст)поаусез 1 ечогз. Микробиология, 1986, т. 47, с, 479-484. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДО-Й-АЦЕТИЛМУРАМИДАЗЫ И КОМПЛЕКСА ЛИЗИРУЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ(51) Использование: биотехнология, Сущность изобретения: для культивирования 2продуцента используют среду, содержащую ф) кукурузный экстракт 0,8 - 1,2; натрий хлористый 0,4-0,6; глюкоза 0,4-0,6(дробная подача); аммоний сернокислый 0,3 - 0,4; мел технический 0,4 - 0,5; крахмал картофельный 0,5 - 0,6; рН 7,4-7,8. Выращивание Ятгертоаусез 1 ечог)з проводят глубинным способом при 26 - 28 С в течение 56 - 70 ч с последующим выделением ферментов, При использовании способа упрощается выделение андо-й-ацетилмурамидазы, увеличивается выход ферментных препаратов: андо-М-ацетилмурамидазы в 15-17 раз, а комплекса лизирующих ферментов - 4 - 5 раз, Соответственно в 3 - 4 раза и 8-10 раз увеличивается. удельная литическая активность указанных препаратов.ется повышение выхода и удельной активности целевых продуктов. Из 50 л культу- ральной жидкости получают 1814 мг препарата андо-ацетилмурамидазы с удельной литической активностью 580 Е/мг белка 5 и 2350 мг препарата, содержащего комплекс лизирующих ферментов с удельной литической и протеолитической активностью Еlмг белка и 1130 Е/мг белка соответственно 10Внесение в ферментационную среду кукурузного экстракта ниже 0,8 приводит к замедлению накопления биомассы продуцента и, как следствие, удлинению процесса ферментации. Увеличение в среде 15 кукурузного экстракта выше 1,2 не приводит к увеличению выхода ферментов, Снижение койцентрации хлористого натрия ниже 0,4,4 и увеличение его концентрации выше 0,6% приводит к появлению крупно зернистых микроколоний, удельная активность которых ниже по сравнению с нормальными хлопьеобразными микроколониями, При добавлении в среду аммония сернокислого ниже 0,3 не обеспечивает 25 "достггочного азотного питанйя продуцента, аувеличение ее выше 0,4 не отражается на росте и активности продуцента, СнижеЙиеконцентрации мела техйического ниже 0,4 оь не обеспечивает в полной мере естественную регуляцию рН среды, а повышение ее свыше 0,50 ингибирует активность фермента. При снижении койцентрации крахмала картофельного ниже 0,4 О наблюдается уменьшение выхода биомассы, а при 35 увеличении концентрации крахмала выше 0,6, часть его остается йеиспользованной продуцентом. Наконец, дробная подача глюкозы по 0,2 через каждые сутки ферментации предотвращает катаболитную ре прессию синтеза ферментов, что сйособствует -максимальному накоплению последних в культуральной жйдкостй.Таким образом; отличительными признаками данного сйособа является то, что 45 культивирование проводят на питательной среде следующего состава ф): кукурузный экстракт - 0,8-1,0 (по сырому весу); натрий хлористый - 0,4-0,6; глюкоза - 0,4-0,6 (по 0,2 каждые сутки); аммоний сернокислый - 50 0,3-0,4; мел технический - 0,4-0,5; крахмал картофельный - 0,5-0,6; при рН 7,4-7,8 в течение 56-70 ч с йоследующим выделением ферментов.П р и м е р 1, Культуру 8,1 ечог 1 з 96 55 выращивают в 20 конических колбах емкостью 1000 мл, заполненных 250 мл жидкой ферментационной среды следующего состава ф: кукурузный экстракт - 0,8 натрий хлористый - 0,4; сульфат аммония - 0,3; технический мел - 0,4; картофельный крахмал - 0,5, глюкоза - 0,2 и по ходу ферментации вносятся через каждые 24 часа по 0,2 ф(,; рН среды 7,8; стерилизация при 0,8 атм 30 мин. Колбы инокулируют 5 (по объему) двухсуточного вегетативного мицелия 5.1 ечог 1 з 96, выращенного на той же среде глубинным способом, ферментацию ведут на круговой качалке, скорость вращения которой составляет 220 об/мин, при температуре 26 С в течение 70 часов; При этом каждые сутки вносят по 2 г/л глюкозы в процессе ферментации - до 6 г/л. Полученную культуральную жидкость освобождают от мицелия центрифугированием (7000 9, 15 мин, 4). Из полученного нативного раствора осаждают ферменты сульфатом аммония при насыщения 70 О в течение 10 часов при 4 . Осадок собирают на центрифуге Негаецз сЬг 1 зс(100009, 10 мин,4 ), растворяют в 100 мл 0,002 М калийфосфатного буфера рН 8,0 и обессоливают гельфильтрацией на колонке (3,5 х 100 см), заполненной сефадексом Г(грубый). Затем раствор ферментов наносят на колонку (3,5 х 60 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную 0,002 М калийфосфатным буфером, рН 8,0. Элюциюпроводят тем же буфером со скоростью 30 мл/ч, Получают фракцию, которая не сорбируется на ДЭАЭ-целлюлозе, и наносят ее на колонку (3,0 х 60 см) с КМ-целлюлозой, предварительно уравновешенную 0,002 М калийфосфатным буфером, Элюцию проводят со скоростью 20 мл/ч. Белок, элюированный с колонки исходным буфером (0,002 М), представляет собой комплекс литических ферментов с удельной литической активностью 750 Е/мг белка (за единицу активности принимают изменение оптической плотности суспензии клеточных стенок стрептококка группы А тиг 29 М при длине волны 650 нм на 0,001 на 1 минуту при температуре 37 О) и с удельной протеолити-ческой активностью 1200 Е/мг белка (за единицу активности принимают изменение . оптической плотности 0,5 х 10 М раствора Й-бензоил,.-аргинин этилового эфира при длине волны 253 нм на 0,001 на 1 минуту при температуре 37 О). Перед элюцией фермента андо-М-ацетилмурамидазы колонку промывают 0,04 М калий-фосфатным буфером рН 8,0. Белок, элюированный с колонки 0,08 М калий-фосфатным буфером рН 8,0, является эндо-И-ацетилмурамидазой с удельной литической активностью 550 Е/мг белка. Ферментный препарат не содержит протеаз.В результате очистки из 5 литров культуральной жидкости получают 170 мг препарата эндо-Й-ацетилмурамидазы с удельнойлитической активностью 550 Е/мг белка и 220 мг препарата, содержащего комплекс литических ферментов с удельной литиче ской и протеолитической активностью 750 и 1200 Е/мг белка соответственно.П р и м е р 2, Продуцент 8.ечог 1 з 96 культивируют в 100 - литровом ферментере, В качестве посевного материала используют 48-часовую глубинную культуру 8.1 ечог 1 з 96 в количестве 5 от объема питательной среды, Для глубинного культивирования продуцента используют среду, содержащую ф): кукурузный экстракт - 1,2 (по сырому весу), натрий хлористый - 0,6, глюкоза - 0,2 и по ходу ферментации вносится по 0,2 через каждые 24 ч, аммоний сернокислый - 0,4, мел технический - 0,5, крахмал картофельный - 0,6, рН среды 7,4, Готовят в ферментере 50 л питательной среды, которую стерилизуют при давлении 1 атм в течение 30 мин, Перед посевом добавляют 0,15 л подсолнечного масла в качестве пеногасителя. Ферментацию ведут в течение 56 часов при температуре 28. Скоростьвращения мешалки 250 об/мин, аэрация: 1 объем воздуха/1 объем среды/мин.Культуральную жидкость освобождают от мицелия сепарированием. Мицелий отбрасывают. Из оставшегося нативного раствора высаливают белки сульфатом аммония, который вносят в нативный раствор постепенно при перемешивании до конечной концентрации 70% и оставляют на 10 часов при температуре 4 О. Недостаточную жидкость декантируют, оставшийся рыхлый осадок центрифугируют при 10000 9 в течение 20 мин при температуре 4 С. Полученный плотный осадок растворяют в 1 литре, 0,002 М калий-фосфатнога буфера рН 8,0 и проводят в диализ против этого же буфера. После диализа 1/4 часть раствора белков наносят на колонку (3,5 - 100 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную 0,002 М калий-фосфатным буфером, рН 8,0. Полученную первую фракцию нанс 1 сят на колонку (3,5 х 60 см) с КМ-целлюлозой, предварительно уравновешенную 0,002 М калий-фосфатным буфером. Белок, элюированный исходным буфером, представляет собой комплекс литических ферментов. Перед элюцией фермента энда-й-ацетилмурамидазы колонку промывают 0,04 М калий-фосфатным буфером рН 8,0, Фермент эндоацетилмурамидазы элюируют 0,08 М калий-фосфатным буфером рН 8,0.Очистку 3/4 частей ферментного препарата, полученного после диализа, проводят по схеме, приведенной в примере 1, Из 50 литров культуральной жидкости получают 2,1 г препарата, содержащего комплекс ли тических ферментов с удельной литической и протеолической активностью - 900 и 1050 Е/мг белка соответственно, и получают 1,55 г ферментного препарата энда-й-ацетилмурамидаэы с удельной литической активностью - 480 Е/мг белка.Способность синтезировать энда-йацетилмурамидазу определяли также у ряда других штаммов 81 гер 1 огпусез (ечог 1 з, для чего был использован специфический суб 5 10 страт данного фермента - клеточные стенки 8 тгертососсцз руо 9 епез, группы А, Клеточные стенки получали по (3) путем разрушения клеток стрептококка на экструзионном прессе, с последующей отмывкой и отделеП р и м е р 4. Используют культуру 8.1 ечогз К, Условия выращивания и определения энда-Й-ацетилмурамидазной активности как в примере 3, которая состав 50 ляет для штамма 8,1 ечог 1 з К- 72,П р и м е р 5, Используют культуру 8.ечог 1 з К. Остальное, как в примере3. Ацетилмурамидазная активность штамма 8.ечог 1 з Ксоставляет 89 П р и м е р 6. Используют культуру 8.ечог 1 з 96. Остальное - как в примере 3. Лизис клеточных стенок стрептококка (ацетилмурамидазная активность) составляет93 6. нием от клеточных мембран дифференциальным центрифугированием,П р и м е р 3. Культуру 8.ечог 1 з К выращивают в конических колбах, емкостью20 250 мл, содержащих по 50 мл жидкой питательной среды следующего состава (о); кукурузный экстракт - , 1 (по сырому весу),натрий хлористый - 0,5, глюкоза - 1, аммоний сернокислый - 0,35, мел технический -25 0,5, крахмал - 1,5; рН 7,8, В качестве инокулята используют 2-х суточный вегетативныймицелий в количестве 5об., выращенныйна этой же среде глубинным способам. Ферментацию ведут на круговой качалке (22030 об/мин) при температуре 26 С в течение 70часов. Культуральную жидкость освобождают от мицелия центрифугированием(7000 ц,15 мин), В нативном растворе определяютэнда-й-ацетилмурамидаэную активность.35 Для этого отбирают 2 мл нативного раствора, куда добавляют 1 мл суспензии клеточных стенок стрептококка в 0,075 Мфосфатном буфере. Активность определяюттурбидиметрическим методом (2) на спект 40 рометре при длине волны 650 нм и выражают в процентах уменьшения оптическойплотности суспензии клеточных стенок через 60 мин при температуре 37 С. Активность энда-й-ацетилмурамидазы 8.1 ечогз45 К - 4020 составляет 83;.1781296 Составитель Л. КольцоваТехред М,Моргентал Корректор О. Юрковецкая Редактор Заказ 4256Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Установлено, что: 1) способность синтезировать эндо-М-ацетилмурамидазу присуща тем испытанным штаммам вида Я 1 гертовусеэечогэ,2) применение заявляемого изобретения позволяет увеличить выход препарата энда-й-ацетилмурамидазы в 15-17 раз по сравнению с прототипом, а также повысить удельную активность в 3-4 раза. Увеличивается также количество ферментного препарата, содержащего комплекс литических ферментов, в 4-5 раэ, а его удельная литическая активность повышается в 8 - 10 раз. Кроме этого, упрощается метод очистки ферментов на КМ-целлюлоэе за счет отсутствия в ферментном препарате, злюированном с ДЭАЭ-целлюлозы, балластных белков; 3) используемая питательная среда не содержит дорогостоящего гидролизата каэеина фирмы ОГсо,получаемого из пищевого продукта - коровьего молока.Формула изобретения Способ получения андо-й-ацетилмурамидаэы и комплекса лизирующих ферментов, предусматривающий культивирование продуцирующего штамма 31 герсоаусеэ 1 ечог э 96 на жидкой питательной среде, содержащей источник углерода, азота, глюко зу и натрий хлористый с последующимвыделением ферментов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода и удельной активности целевых продуктов, а также упрощения выделения эндо й-ацетилмурамидаэы, в состав жидкойпитательной среды дополнительно вводят мел технический в количестве 0,4-0,5 мас., аммоний сернокислый 0,3-0,4 мас, , в качестве источника углерода ис пользуют крахмал картофельный 0,5-0,6мас. , источника азота - кукурузный экстракт в количестве 0,8 - 1,2 мас., по сырой массе, при этом глюкозу вводят дробно равной порцией через каждые 20 сутки до достижения концентрации всреде 0,4-0.,6 мас.,4, устанавливая рН среды 7,4-7,8 и продолжительность культивирования 56-70 ч.