Способ определения гликозаминогликанов в жидких средах

либо пробирках для микропроб смешивают по 10 мкл 0,05%-ного водного раствора акридинового оранжевого (АО) и по 10 мкл исследуемой жид 5 кости, Смесь инкубируют 20 мин и пе- реносят микрошприцем или автоматической пипеткой по 15 мкл смеси в лунки в агароэном геле. Чашку Петри закрывают и оставляют на 4 ч при комнатной 10 температуре. За это время не связанный ГАГ исследуемой жидкости избыток ДО диффундирует в гель и формирует с гепарином видимое копьцо преципитации. Для измерения диаметра кольца спользуют конусную линейку, изготовленную из масштабной бумаги Конусная линейка располагается под лном чашки Петри и кольцо преципитации совмещается с соответствующим ее диаметру участком конуса, Концентраию ГАГ определяют по калибровочной ривой, построенной в координатах Диаметр кольца преципитации (мм)/ /концентрация ГАГ в стандартных раст ворах (мг/мл), В качестве стандартных растворов ГАГ используют растворы хондроитинсульфата в 0,15 М растворе хлористого натрия в пределах концентраций 0,05 - 0,3 мг/мл. При этом диаметр кольца преципитации изМеняется соответственно от б,9 ф 0,1 мм ро 5, О+0,1 мм (нижняя граница чувстительности 0,5 мгк ГАГ). Повышение онцентрации гепарина и/или АО позоляет, при необходимости, получать алибровочные кривые для определения онцентрации ГАГ в более высоких концентрационных пределах, Наличие в исследуемой жидкости белка в концентрации 4 мг/мл не препятствует взаимодействию ГАГ и АО. П р и м е р 1, Построение калибровочной кривой для стандартных45 растворов ГАГ,Для построения калибровочной кривой готовят 1 мл 0,05%-ного водного раствора АО и по 1 мл стандартных растворов хондроитинсульфата (ХС) в концентрации 0,05; 0,10; 0,20;0,30 мг на 1 мл 0,15 М раствора хлористого натрия. В ячейках планшета для иммунологических реакций смешивают по 10 мкл стандартного раствора ХС и 10 мкл раствора АО . Яо 15 мкл смеси переносят в лунки в агарозном геле и через 4 ч производят измерение диаметров колец преципитации. Результаты измерения представлены в табл, 1,П р и м е р 2, Определение суммарного содержания ГАГ в растворе протеогликанов (ПГ).Для определения вносят в ячейкупланшета, содержащую 10 мкл 0,05%-ного раствора АО, 1 О мкл раствора ПГв концентрации 0,2 мг на 1 мл 0,15 Мраствора хлористого натрия. 15 мклсмеси переносят в лунку в агарозномгеле, через 4 ч измеряют диаметркольца преципитации и по калибровочной кривой (пример 1) находят соответствующую концентрацию ГАГ, Результаты измерения для двух препаратовПГ приведены в табл. 2 и свидетельствуют о том, что содержание ГАГ висследуемых препаратах составляет90 и 85% от общего содержания ПГ врастворах.П р и м е р 3. Оценка специфичности взаимодействия АО с ГАГ,Для исключения возможного влияниябелков на взаимодействие АО с ГАГиспользуют сыворотку здоровых доноров (п=4), в которой концентрацияГАГ(0,05 мг/мл, Результаты измерения диаметра колец преципитации, образовавшихся при отсутствии сыворотки и при ее добавлении, представленыв табл, 3 и свидетельствуют, что при -сутствие белка не влияет на взаимосвязь АО с ГАГ, так как диаметры образовавшихся колец зависят в даннойсерии экспериментов лишь от содержания ГАГ в пробах,П р и м е р 4, Определение концентрации ГАГ в моче больных ортопедического стационара с целью выявлениягигерэкскреции ГАГ,Для выявления повышенной концентрации ГАГ в моче пригодна калибровочная кривая, приведенная в примере 1.Нормальный уровень экскреции ГАГ менее 0,14 мг/мл, все более высокиезначения могут указывать на нарушениеметаболизма ГАГ. Для таких больныхнеобходимы, дополнительные клиниколабораторные обследования в специальных биохимических лабораториях, Дляопределения берут 0,05%-ный водныйраствор АО (необходимый объем реагента определяется числом обследуемых больных из расчета 1 О мкл АО наодно определение), Вносят по 1 О мклраствораАО в лунки планшета для5 154 иммунологических реакций. Затем микрошприцем добавляют в каждую лунку по 1 О мкл мочи обследуемых пациентов. Для шифровки образцов мочи используют цифры 1-12 (по горизонтали) и буквы А-Н (по вертикали), имеющиеся на бортиках планшета (пример шифров А, А, В, Си т.д.). Через 4 ч после переноса 15 мкл каждой смеси в лунки в агарозном геле измеряют диаметры колец преципитации. Затем по калибровочной кривой определяют концентрацию ГАГ и выявляют больных,имеющих концентрацию ГАГ больше 0,14 мг/мл (табл. 4). Для точного определения концентрации ГАГ, превышающей 0,3 мг/мл, проводят повторное определение путем добавления двух объемов АО (20 мкл) и к 1 О мкл мочи (необходимость повторного определения при очень высоком содержании ГАГ в пробах возникает и при иснользовании,известных способов. Приведенной в примере 1 калибровочной кривой в принципе достаточно для выявления больных с патологической концентрацией ГАГ ( 0,14 мг/мл). В табл. 4 это больные А, А, А, А-б, В-З,В, С-З, С. В данную группу попали все больные с мукополисахаридозами - заболеваниями, связанными с нарушениями деградации ГАГ, при которых наблюдается повышенная экскреция ГАГ с мочой.5166ных медицинских учрежденияхДажепри наличии только одной чашки Петридиаметром 10 мм (42 лунки) можно ис -5,.следовать 34 пробы и построить калибровочную кривую по 4 точкам в дублях.Предлагаемый способ сокращает времяопределения - это примерно 5 ч с момента получения проб до момента определения в них концентрации ГАГ, Известный способ требует более суток(пробы предварительно диализуют в те-чение нОчи), Для определения концентрации ГАГ предлагаемым способом необходимо не более 40-50 мкл исследуемой жидкости, для известного способа -не менее 200 мкл (в связи со сложностями при проведении диалиэа меньшегоколичества жидкости).20 Способ позволяет просто, быстрои с использованием меньшего количества исследуемой жидкости определятьконцентрацию ГАГ в больших серияхобразцов, Способ может быть широко25 использован в клинической биохимии,при проведении массовых обследованийвне специализированной биохимическойлаборатории, в медицинской промышленности для контроля производственных30 этапов при получении лекарственныхпрепаратов, содержащих ГАГ (гепарина,хонсурида и др.) и в экспериментальных работах,ФоРмУла изобретенияОтличием предлагаемого способа является техническая простота выполняемых операций, сокращение времени проведения большого числа определений, возможность использования микро- проб тестируемых жидкостей, Упрощение способа состоит в том, что для определения не требуется дорогостоящее оборудование, устраняется ряд трудоемких операций - например, диалиэ проб, При наличии предварительно залитых агароэой чашек. Петри возможно проведение массовых обследований определенных групп населения в экспедиционных и полевых условиях, например, при выявлении больных с мукополисахаридозами в специализирован. -Способ определения гликозаминогликанов в жидких средах, включающий обработку исследуемой пробы красителем, 40 отличающийся тем, что,с целью упрощения способа эа счет сокращения числа трудоемких .операций при одновременном уменьшении объема исследуемой пробы, к пробе добавляют 45 акридиновый оранжевый, смесь вносятв лунку в агарозном геле, содержащем гепарин, инкубируют, затем измеряют диаметр образовавшегося кольца преципитации и определяют концентрацию 50 гликозаминогликанов, которая находится в обратно пропорциональной зависимости от диаметра кольца преципитации.1545161Таблица 1 Объем раствора ХС, вноОбъем смеОбъем Концентрация ХС,мг/мл Диаметркольцапреципитации,мм си, переносимой в симого в яче-.йку планшета,лунку в агароэном геле,мкл Таблица 2 кспе- имент КонПроцентное соОбъем Диаметркольца Объем Объем центрация ГАГ,мг/мл смеси, переносимой в держаниеГАГ в пробах ПГ, % преципитации,лунку,мкл 0,18 90 О, 16. 85 5,9 6,1 1515 10 10 0,2 10 0,2 10 1 2 Таблица 3 Диаметркольцапреципитации, мм Расчетная Объем Экспе- римент Объемы реагентов, вносимых в ячейку планшета, мкл концентрация ХС,мг/мл смеси,переносимой в сыворот- АО ХСка лунку,мкл 10 5 0,2 15 10 О 0,1 15 10 5 0,8 15 10 10 0,4 15 1 2 3 4 0,05 0,10 0,20 0,30 КонцентрацияраствораПГ, мг/мл 10 10 10 10 раствораПГ, вносимого вячейку.планшета,мкл раствора АО, вно; симого в ячейку планшета 1 О 10 1 О 1 О раствораАО, вносимо го вячейкупланшет амкл Концентрациястандартного раствораа ХС, мг/мл 15 15 15 15 6,2 6,2 4,9 4,9 6,9 6,5 5,8 5,0 0,1 О, 0,4 0,4ар ть больн 0(0,0 больн Н орава, м6 ле истемное заболева Н 0,0 т А келетапондилоэпифизарная 2 6 дисплазияПсевдоахондроплази Здорова, мать боль А10 лет 30 лет(0,0 0,07 3 го сеопл 0,1 (О, (О,2 г.9 лет36 ле В- Взи ольного Н те Н лаэия онд эпи вдо лет лет зарная 29 лет 4 года 30 лет е а ти сахар мать В В0 ольно Н 39 л льн 8 7 5 ожеств-12 ле ият больног О,года 10 ов, брат больног 6 лет9 ондро ьюсик 5. Здоров, бВя эпи изарофия Мак ьПроизводственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул, Гагарина, 101 Заказ 488 Тираж 522 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 1 13035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5