Способ получения пептидов

, 1575944 7/10//А 61 К 37/ ц С ИЗОБРЕТЕНИ НТУ 2указанного класса. Синтез пептида ведут связыванием С-конечной аминокислоты - глицина с защищенной ИН -группой с полимером-носителем - смолой МВНА в соотношении 2 ммоль аминокислоты на 1 г смолы в среде метиленхлорида или диметилформамида, или их смеси. Затем проводят постепенное наращивание пептидной цепи в соответствии с целевым пептидом до образования пептидилполимера ф-лы Х-К(Х, или Х)-А 1 а-Аяр(Х,)- -А 1 ае-Рйе-Тйг(Х -Аяп(Х)-Бег(Х )- -ТУг(Х)-Агя(Х,) -Ьуя(Х,)-Ча 1-Ьец-С 1 у-С 1 п(Х )-Ьеп-Бег(Х)-А 1 а-Агд(Х )-Ьуя (Х ) -Ьеп-Ьеи-С 1 п(Х ) -Аяр (Х ) -11 е-К - -Бег(Хз)-Агд(Х )-С 1 п(Х ) -С 1 п(Х )-С 1 у (Х 7), где К, и К указаны выше, Х- -Вос Х -тозил Х -ОВк 1 Х -бензил1 ф з ю Х-дихлорбензил; Х -ксантил; Х -2-, хлорбензилоксикарбонил, Х -смола-носитель МВНА. Далее проводят деблокирование пептидилполимера и отщепление пептида с помощью НР совместно с акцептором-анизолом или метилэтилсульфио дом, или их смесью, при 0-(-20) С с последующим растворением в уксусной кислоте и очисткой. 1 табл. Сокра.нииЛСС-И,ИНОВОярВосТоя2 С 1-еЛСВОВк 1- дициклогексилкароодиимид1-гидроксибензтриазол;- и-нитрофенил;третбутилоксикарбонил;- 4-толуолсульфонил;- 2-хлорбензилоксикарбони- 2,6-дихлорбензил;- сложный бензиловый эир ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Дзе Салк Институт фор Биолоджикал Стадиз(ПБ )(72) ЖанЭдуард, Фредерик Ривьер (СН), Вили Балкер Вэйл (мпадший)(ПБ) и Иохим Шписс (РЕ)(56) Химия полимеров./Под ред.Катсояниса П. М.: Мир, 1977, с. 368. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ(57) Изобретение касается пептидов, в ча стности получения соединений общей ф-лы НК;А 1 а-Аяр-А 1 ае-РЬе-ТЬг-Аяп-Бег- Туг-Агн-Ьуяа 1-Ьеи-С 1 у-С 1 п-Ьеи-БегА 1 а-Агд-Ьуя-Ьеи-Ьеи-С 1 п-Аяре-К, - Бег-Аг 8-С 1 п-С 1 п-С 1 у-БН где К - Туг или Ндя; К , - И 1 е, Мег для использования в медицине как ростостимулирующих средств. Цель - создание новых более активных и малотоксичных веществ Изобретение относится к способу получения пептидов - аналогов Ьр СВУ человека, новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине.Цель изобретения - способ получения новых пептидов-аналогов Ьр СКР человека, малотоксичных, обладающих более высокой ростостимулирующей активностью. ения, используемые в описа 157594460% трифторуксус 35 ная кислота/2%этандитиол 1060% трифторуксусная кислота/2%этандитиол 151 РА/1% этаццитиол 0,5ЕСЛИ (10%) в СНС 1 0,5 МеОН 0 5ЕЕ И (10%) в СН С 1 0,5МеОН (дважды) 0,5СНС 1 (дважды) 0,5Связывание предпочтительнее осуществлять по программе В.Программа ВРеагент Время смешива 50ния, мин 40 ЭСС (Ы,И-дициклогексилкарбодиимид) Вос-аминокислота МеОН (дважды) СН С 1 (дважды) АсО (ЗМ) в СН С 1 СН С 1 50-90 05 05 150 05Л р и м е р 1, Синтез И 1 е 3-ЬрСКР/1-32/-ИНр имеющего формулуН-Туг-А 1 а-Азр-А 1 а-Т 1 е-Рпе-Тпг-АяпЗег-Туг-Агр-Ьуя-Ча 1-Ьец-С 1 у-С 1.п-ЬецЯег-А 1 а-Агя-Ьуз-,1,ец-Ьец-С 1 п-Аяр-ПеИ 1 е"Яег-Аг-С 1 п-С 1 п-С 1 у-МН, осушествляют ступенчато, используя пептидныйсинтезатор "Бекман", на смолехлоргидрата МВНА, такой, например как 10смола, поставляемая фирмоч Василев,ТЬс, имеющая диапазон замещения от-О, 1 до 0,5 ммоль/г смолы. СвязываниеВос-С 1 у к смоле осуществляют способом,описанным в программах А и В, которйй 15используют в ходе всего синтеза, чтоприводит к замещению примерно0,35 ммоль глицина на граммсмолы,Все используемые растворители тщательно обезгаживают путем продувки инертным газом, например гелием или азотом,чтобы гарантировать отсутствие кислорода, который может окислить серу ос татка метионина, что нежелательно.После удаления защиты и нейтрализации пептидную цепь ступенчато наращивают на смоле. Удаление защиты,нейтрализацию и добавление каждой аминокислоты осуществляют по сформулированным ниже программам, 30Удаление защиты предпочтительнееосуществлять по программе А,Программа АРеагент Время смешивания,мин МеОН 0,5 СНС 1(дважды) 0,5Таким образом, от 1 до 2 ммоль Вос-защищенной аминокислоты в хлористом метилене используют на грамм смолы в сочетании с одним эквивалентом 1,0 М ОСС 1 в хлористом метилене в течение 2 ч. Когда Вос-Агр (ТОЯ) связан, используют смесь 50% диметилформамида и хлористого метилена, Бензиловый эфир используют в качестве защитной гидроксильной группы боковой цепи для серина и треонина, Пара-нитрофениловый сложный эфир (ОЫр) используют для активации карбоксильного конца аснатина или глицина. Например, Вос-Азп(ОИр) связывают в течение ночи, используя один эквивалент НОВГ в 50% смеси диметилформамида и хлористого метилена, причем в этом случае ЭСС не добавляют. Аминогруппу аснатина и глутамина защищают ксантилом, если ВСС-связывание применяют вместо использования активного эфира, 2-хлорбензилоксикарбонил (2 С -2) используют в качестве защитной группы для боковой цепи лизина. Для защиты гуанидиногруппы аргинина используют тозил, а карбоксильную группу глицина или аспарагина защищают сложным бензиловым эфиром (ОВк 1) . Фенольную гидроксильную группу тирозина защищают с помощью 2,б-дихлорбензила (ПСВ), В. конце синтеза получают следующую композицию:Х-Туг(Х)-А 1 а-Аяр(Х )-А 1 ае-РЬе-Тпг(Х )-Аяп(Х)-Яег(Х )-Туг(Х) - -Агр(Х )-Ьуз(Х,)-Ч 1-Ьец-С 1 у-С 1 п(Х ) - -Ьец-Яег(Хз)-А 1 а-Агр(Х )-Ьуз(Х)- , -Ьец-Ьец-С 1 п(Х )-Аяр(Х ) -11 е-И 1 е" -Яег(Хз)-Агд(Х,)-С 1 п(Х)-С 1 п(Хь) - -С 1 у-Х 1, где Х представляет собой Вос, Х- тозил, Х- сложный бензиловый эфир (ОВя 1), Х з - бензил, Х - дихлорбензил, Х- ксантил, Х- 2-хлорбенз" илоксикарбонил и Х 7 - -ЫН-подложка смолы, Ксантил может быть частично или полностью удален при обработке трифторуксусной кислотой, используемой для удаления с-аминозащитной группы.После связывания остатка тирозина со смолой Вос удаляют с помощью 60%-ной трифторуксусной кислоты в СНдС 1. Для расщепления и удаления защиты с оставшегося защищенного пептида-смолы его обрабатывают 1,5 мл анизола, 0,5 мл метилэтилсульфида и 15 мл фтористого водорода,(НЕ) награмм пептида-смолы при -20 С в течеоние 1 - 0,5 ч и при 0 С в течение 1 - 0,5 ч. После удаления НР под высоким вакуумом остаток смолы-пептида промывают поочередно безводным диэтиловым эАиром и хлороформом, а затем пептид экстрагируют обезгаженным 2 н. раствором уксусной кислоты и выделяют из смеси Аильтрованием.10Отщепленный и лишенный защиты пептид растворяют в 0,5%-ной уксусной кислоте и подвергают очистке, которая может включать тонкую гель-Аильтрацию на "СеАадексе ЛС - 50".15Затем пептид подвергают дальнейщей очистке с помощью препаративной или полупрепаративной высокоэАФективной жидкостной хроматограАии. Гильзы для ЕеАирмы Иаегя аяяос 1 аея 20 заполняют С кремнеземом 15-20 мк, поставляемым Аирмой Чуйас (ЗООА) . Градиент ацетонитрила создают с помощью аппарата для получения градиента низкого давления Аирмы Е 1 йех. Хро матографические Аракции тщательно контролируют с помощью высокоэАФективной жидкостной хроматографии и объединяют только Аракции, проявляющие существенную частоту. Обессоливание 30 очищенных Аракций, проверенных на чистоту независимо, осуществляют, используя ацетонитрил в 0,1 -ной триАторуксусной кислоте. Окончательное элюирование осуществляют из аналитической колонки Чуда 1 С, (5 мк), используя смесь буАеров А и В. Буфер А представляет собой 0,1 -ную водную трифторуксусную кислоту; буАер В содержит 60 об.ацетонитрила, О, 1% трифторуксусной кислоты, остальное - НгО, Для изократической смеси, содержащей 58 об.буАера В, пептид элюируют при 9,2 мл, Центральный срез лиофилизируют, чтобы получить нужный пептид, чистота которого составляет свьпде 98%.Оптическое вращение измеряют на Фотоэлектрическом поляриметре, как величину Га 3=-57,8 +1 (С=1,1 -ная уксусная кислота, нескорректировано).П р и м е р 2, Синтез йр СКР аналога О-Туг 1-йр СЕР(1-32)-ИН, имеющего Аормулу Н-О-Туг-А 1 а-Аяр-А 1 ае-Рйе-ТЬг-Аяп-Бег-Тг-АгР,я-Ча 1-ЬецЛ 55 -С 1 у-С 1 п.ец-Бег-А 1 а-Агд-Еу я-Ьец- -1,ец-С 1 п-Аяре-Ме г-Бег-Агя-С 1 п-С 1 п-С 1 у-ИН , проводят ступенчато, используя пептидный синтезатор "Бекман", на смоле 1 БНА по способу, описанному в примере 1. Определяют чистоту пептида с помощью тонкослойной хроматограАии и высокоэффективной жидкостной хроматографии при элюировании из колонки при 8,6 мл с использованием 60 об. . буфера В. Оптическое вращение измеряют на Фотоэлектрическом поляриметре, как величину Г 3 =-61,4+1 (С=1,1%-ная уксусная кислота, нескорректировано) .П р и м е р 3. Синтез СП-Ме 3- - 1 р СЮ(1-32)-ИН, имеющего Аормулу Н-Туг-А 1 а-Аяр-А 1 ае-Рпе-Тйг-Аяп-Бег-Туг-Лг 8-Ьуя-Ча 1-Ьец-С 1 у-С 1 п-Ьец-Бег - Л 1 а-Агц-Еуя-,ец - Еец - С 1 п-Ляре-П-Мег-Бег в Л-С 1 п-С 1 п - С 1 у-ИН, осуществляют ступенчато, используя пептидный синтезатор "Бекман", на смоле 11 ВНЛ по способу, описанному в примере 1. Определяют чистоту пептида с помощью тонкослойной хроматограФии и высокоэФАективной жидкостной хроматографии при элюировании из колонки при 7,6 мл с использованием 573 буфера В. Оптическое вращение измеряют на Аотоэлектрическом полярно+ метре, как величину ГЫ= - 54,5 "-1 (С=1, 1%-ная уксусная кислота, не- скорректировано) .П р и м е р 4, Синтез Суя 3-Нр СКР (1-32) -МН , имеющего Аормулу Н-Н 1 я-Л 1 а-Аяр-А 1 ае-РЬе-ТЬг-Аяп-Бег-Туг-Лго - 1,уя - Ча 1-1.ец-С 1 у-С 1 п.ец-Бег-А 1 а-Лгд.уя-Ьец.ец-С 1 п-Аяре-МеГ-Бег-Лгс,-С 1 п-С 1 п-С 1 у-МН, осуществляют ступенчато, используя пептидный син.езатор "Бекман", на смоле МВНА по способу, описанному в примере 1, Определяют чистоту пептида с помощью тонкослойной хроматограАии и высокоэФАективной жидкостной хроматографии, при элюировании из колонки при 9,0 мл с использованием 54 буАера В. Оптическое вращение измеряют на Фотоэлектрическом поляриметре, как величину Гм 3 в =-58,7 +1 (С=1, 1%-ная уксусная кислота, нескорректировано).Синтез повторяют, используя Н 1 я в качестве последнего остатка, чтобы получить (Ня )-Ьр ЖР(1-32)-МН. Определяют чистоту пептида при элюировании из колонки при 9,2 мп с использованием 58% буАера В. Оптическое вращение измеряют на Аотоэлектрическоми поляриметре, как величину3= =-58, 2 +1 (С=1, 1 -ная уксусная кислота, нескорректировано).П р и м е р 5. Синтез Сув", ТТ 1 еу -Ьр СКР(1-32)-ИН, имеющего формулу Н-Ндв-А 1 а-Авр-А 1 а-Пе-РЬе-, Тйг -Авп-Бег-Туг-Агя-Т.ув-Ча 1-Ьец-С 1 у-С 1 п-Ьец-Зег-А 1 а-Агя-Ьув-Ьец.-Ьец-С 1 п-Авр-ПеИ 1 е-Бег-Аг 8-С 1 п-С 1 п-С 1 у-ТТН, осуществляют ступенчато, используя пептидный синтезатор "Бекман", на смоле МВНА по способу, описанному в приме ре 1. Определяют чистоту пептида с помощью тонкослойной хроматографии и высОкоэффективной жидкостной хроматографйи, при элюировании из колонки при 9,6 мл с использованием 573 буфера В. 15 Оптическое вращение измеряют на фотоэЛектрическом поляриметре, как величину (с 3 д=-59,341 (С=1, 1 Е-ная уксусная кислота, нескорректировано).Синтетические пептиды, полученные 20 в различных примерах, сравнивают с очищенным синтетическим Тр СКГ(1-40) - -ОН либо с очищенным синтетическим Ьр СКР(1-40)-Фен-Гли-ИН в анализах з.п ч 1 Гго, чтобы определить их эффективность как стимуляторов выделения гормона роста. Все эти синтетические аналоги обладают существенной действенностью в стимулировании выделения гОрмона роста. 30Анализы з.п чз.Сго выполняют с использованием синтетического Ьр СКГ в качестве стандарта при параллельном сравнении с эквимолярными концентрациями различных синтезированных аналогов, Используют культуры, содержащие клетки питуитарных желез крысы, удаленные за четыре-пять дней до этого, Культуры, которые считаются опти мальными для выделения гормона роста, используют для сравнительного испытания по общему способу. Инкубирование с испытуемым веществом осуществляют н течение 3 - 4 ч. Аликвоты культу- ральной среды удаляют и обрабатывают для измерения содержания н них иммунореакционного гормона роста (1 г СН) известным способом радиоиммуноанализа.Результаты сравнительного испытания с использованием эквимолярных концентраций приведены в таблице.Испытание 1 п чанг,го синтетических пептидов показывает, что эффективная концентрация ЕС изменяется от 205 одо 100 пМ. Самая низкая эффектинная концентрация составляет 3-8 пМ, Максимальная эффектинная концентрация для Ьр СКЕ(1-40)-ТТН состанляпа 1 нМ. Кроме испытаний ап ч 1 гго проведены эксперименты 1 п чиччо путем введения синтетического пептида через постоянный катетер свободно передвигающимся самцам нормальных мышей. Животных предварительно обрабатывают РЬА-б 3 допамингидроксилазным ингибитором, который подавляет спонтанное выделение. гормона роста, ,не влияя на реакцию к экзогенному гормональному выделительному фактору (СКГ) . Образцы крови берут через тот же самый катетер перед введением, через 5 и 20 мин после инъекции, Содержание гормона роста в крови измеряют путем радиоиммуноанализа.Результаты показывают, что синтетические аналоги являются сильнымистимуляторами выделения питуитарногогормона роста,В испытаниях 1 п 7"-гго соединениеЭ-Туг,йр СКУ Г 1-323 ТТНнесколько слабее, чем соответствующий природныйгормон. В испытаниях хп 1 чо оно проявляет биологическое действие по высвобождению гормона роста, котороесущественно выше действия соответствующего гормона с незамещенным 32 остатком, а также выше стандарта.Проведенные испытания показали,что соединения по изобретению малотоксичны и проявляют высокую ростостимулирующую активность.Формула изобретенияСпособ получения пептидов общей формулыНК -А 1 а-Авр-А 1 ае-РЬе-ТЬг-Авп-Бег-Туг-Аг 8-Ьув-Ча 1-Ьец-С 1 у-С 1 п-Ьец-Бег-А 1 а-Агя-Ьув-Т.ец-Ьец-С 1 п-Авре-К ,-Бег-Агя-С 1 п-С 1 п-С 1 у-ИН.где К- Туг, Р-Туг или Н 1 в;К- Т 11 е, Ме,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что С-конечную аминокислоту - глицин с защищенной аминогруппой связывают с полимером-носителем - смолой МВНА н соотношении 2 ммоль аминокислоты на 1 гсмолы, н метиленхлориде, или циметилформамиде, или в их смеси и проводят постепенное наращивание пептидной цепи в соответствии с целевым пептидом до образования пептидилполимера общей формулыХ-К (Хили Х) -А 1 а-Авр(Х,) -А 1 ае-Рйе-Ъг(Х )-Авп(Х )-Бег(Х )-Туг3 Э (Х ) -Агр (Х,) -Т,ув (Х ) -ЧаТ-Т,ец-С 1 у1575944 Биологическая активность описываемых пептидов Пептид Относительная действенность хп чйго И 1 е 3 -Ьр СКУ(1-32) -ЮН 2,Н 1 яГ-Ьр СКР(1-32) -ИНП-Тг -Ьр СКА(1-32) -ЯННоя Г, Ж 1 е1-Ьр СКР (1-3 2) -МН3,21(2,02-5,4.") 2, 15 (1, 12-4,4 1) О, 74 (0,4 7-1, 14) 3,22 (2, 12-5,33) П р и м е ч а н и е: Относительно Ьр СКУ(1-40)- -РЬе-С 1 п-ИН . Составитель В.ВолковаРедактор А.Маковская Техред М.Дрык Корректор Л.Патай Заказ 1793 Тираж 318 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101-Ьуя (Хс ) -Ьец-Ьеи-С 1 п (Х) -Аяр (Х ) -11 е-К 7-Бег (Х ) -Аг р (Х ) -С 1 п (Х) -С 1 п (Х ) - -С 1 у(Х,)где К и К имеют укаэанные значенияХ - Вос;Х в , тоэил;Х . - ОВя 1;Хэ - бенэил;О Ха - дихлорбензилф Х - ксантил;Х - 2-хлорбенэилоксикарбонил; Х - смола-носитель МВНА, и полученный пептидил-полимер деблокируют и отщенляют пептид с помощью -НР вместе с акцептором, таким, как аниэол, метилэтилсульфид или их смесь при температуре 0-(-20)0 С с последующим растворением в уксусной кислоте и очисткой.