Способ получения антибиотика макролида

/06// ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССС О ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫ ЗСЕГОЮЗИ13 ЗОБ ТЕ" МЕЛКОТЕ НИ И А АТЕНТ(54) СПО ИАКРОЛИД ЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТ 13 9 37Р)8,8)11.)1980 29з СЬешогЬег 963. В рЬ ез. Сошши СННО НО(СНдг где К, - водороК - водороиспользуют извесез ашЪойасепзвыращивают в жиде, содержащейазота и минералусловиях, Черезначала культивиную среду вводямикаминозилпрот или ацетил; или микарозитный штамм ЯгЛТСС 15154,л,гер гошукоторый ой срерода,эробныхпосле и питателочники угл ные соли, в 24 ч и боле(56) СЬеш. рЬагАп г 1.ш 1 с гоЪ.1981, 2 Я 214.В 1 осЬеш, В 1 о1982 107 554 ования в культуральпротилонолид, 5-олонолид, 20-оксо- отилонолид или 20 Р 1/06 С 12 К 13465),(57) Изобретение относится к областибиотехнологии и касается полученияантибиотика-макролида, называемогоРТЬ. Цель изобретения - созданиеспособа получения новых антибиотиковмакролидов, активных в отношенииширокого спектра микроорганизмов, вт,ч, шусор 1 азва, Для получения антибиотика и его производных формулы-гидр ок си-о-мик ано зилпр о тило нолидв концентрации 10-15 мг/100 мл культуральной жидкости, Отделяют фильтро-ванием жидкую фракцию,экстрагируютцелевой продукт и подвергают колоночной хроматографии. Выделяют фракции,содержащие целевой продукт указаннойформулы, где К - микарозил, и принеобходимости подвергают гидролизус получением целевого продукта, гдеК - водород. 5 табл.51015 20 25 30 сн,О Но Мекай,О0О-Й 1 С 11 З и являютс Р, Раств ле, ацетое, бензоле Изобретение относится к биотехнологии, в.частности к производствуантибиотиков,Целью изобретения является разработка способа получения новых антибиотиков-макролидов, активных в отношении широкого спектра микроорганизмов.Макролидные антибиотики (РТЬпроизводные) получают путем аэробного культивирования штамма БСгер 1 ощусев ащЬоГасдепв АТСС 15154. Приэтом получают два основных продуктаферментации - РТЬА и В, и двадополнительных - РТЬС и Р, которью получают гидролитическим отщеплением микарозного сахара от основных продуктов. Зти демикарозиловыепродукты наиболее активны,РТЬ-производные представляютсобой стабильные белые порошки.Продукты РТЬА, В, С и Р предположительно имеют следующую структуру: 6Величина химического сдвига С-ЯМР-спектра (в СРС 1, ) продукта РТЬА, млн : 202,3; 171,1; 170,8;1311 13591 1330 1288 1042 101,1; 96,4; 80,5; 79,1; 76,4; 74,8;66,1; 44,0; 42,0; 41,0; 40,7; 38,9;Величина. химического сдвига С-ЯМР-спектра (в СРС 1 ) продукта РТЬВ, млн : 202,7; 174,9; 135, 1;134 8; 133 9; 129 5; 105 О; 102 4;8,3. Следующие характеристи общими для РТЬА, С и римость: в метаноле, этан не, этилацетате, хлорофор 35 40 45 50 55 слаборастворимы в эфире, н-гексане,немного растворимы в воде. Цветоваяпроба: положительная - Драгендорфа,анисовый альдегид-серная кислота,2,4-динитрофенилгидразин, отрицательная - нингидрин, РеС 1 , Рейдона-Смита,В табл1 дана Физико-химическаяхарактеристика антибиотиков А, В, Си Р,РТЬ-производные приведены втабл. 2,В приведенной структурной формулестереохимия не показана, но предполагается, что различные составляющие,части молекулы имеют ту же стереохимическую конфигурацию, что и протилонолид (лактон вцентре) форозамин (лактон слева), микаминоза (сахар справа), Протилонолид-форозаминовая связь предположительно имеет стереохимическую конфигурацию 90-./- -фороэаминилаНаличие аминовых функций в структуре формулы (1) означает, что свободные основания способны образовывать соли. Подобные соли, если они достаточно нетоксичны при употреблении для хемотерапии теплокровных животных, могут использоваться в качестве антибиотиков, К их числу относятся соли образованные в реакциях как с органическими, так и с неорганическими солями, такими как сер-.ная, хлористоводородная, фосфорная,уксусная, янтарная, лимонная, молочная, малеиновая, фумаровая, пальмитиновая, холевая, памоевая, слизевая,Р-глютаминовая, й-камфорная глутаровая, гликолевая, фталевая, винная, муравьиная, лауриновая, стеариновая, салициловая, метансульфоновая, бензолсульфоновая, сорбиновая,пикриновая, бензойная и коричнаякислота,П р и м е р 1, Штамм 51 терошусев ашЬойас 1 епв АТСС 15154 (МВЯ.2420) выращивают в 100 мл среды, содержащей, 7.: глюкоза 2; мясной экстракт 0,5; пептон 0,5," сухие дрожжи 0,3", хлористый натрий 0,5; углекислый кальций 03, при рН 7,0 воколбе Сакагучи на 500 мл при 27 С втечение 48 ч при встряхивании. Полученный посевной материал переносятв 100 мл ферментационной среды, содержащей, 7: глюкоза 1,0; сухиедрожжи 1,0; хлористый натрий 0,5;3 13 углекислый кальций 1,0; азотнокислый натрий 0,1рН 7,5 в колбе Сакагучи на 500 мл, Культивирование осущестОвляют при 27 С в условиях встряхивания.В начале культивирования и спустя 24 и 48 ч в колбу добавляют перу- ленин в растворе и небольшом количестве этанола по норме 4 мг в колбу, Через,24 ч после начала культивирования в колбу добавляют протилонолид в растворе в небольшом количестве этанола по норме 10 мл на колбу. Культивирование продолжают в течение 72 ч, на протяжении которых рН среды не регулируют.Мицелий и осадок отфильтровывают от, культуральной среды 100 колб Сака гучи с получением 8,5.л фильтрата, Фильтрат доводят до рН 8,5 добавлением 6 н, раствора гидроокиси натрия и дважды экстрагируют тем же количеством бензола, Бензольный слой концентрируют до сухого остатка с получением 1,3 г желтого порошка. Этот йорошковый продукт после суспендирования в хлороформе добавляют в колонку, набитую силикагелем (продукт У 7734, выпускаемый фирмой "Мерк"), и элюируют смесью хлороформ(метанол) концентрированный водный аммиак (10/1/0,05)Каждую фракцию (20 мл) анализируют с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле( продукт У 5554 фирмы "Мерк", проявляющий рас творитель - смесь хлороформ(метанол) концентрированный водный аммиак 15/1/0,05) для выявления тех фракций которые содержат соединение, имеющее значение КЕ около 0,26, Эти фрак ции собирают и концентрируют при пониженном давлении с получением 96 мг смеси РТЕА и РТЬВ в виде белого порошка.Для дальнейшего разделения этих веществ проводят тонкослойную хроматографию окиси алюминия (продукт У 5550 фирмы "Мерк", проявляющий растворитель - смесь этилацетат/бензол 6/1). Полосы со значениями Ы 0,6 и 0,4 собирают, элюируют этилацетатом и концентрируют с получением 37 мг РТЕА и 45 мг РТЬВ в ви де белых порошков.П р и м е р ы 2-4, Пример 1 повторяют с тем отличием, что протилонолид - вещество, добавляемое в качестве исходного материала спустя44248 5 10 15 20 25 3035 140 45 50 55 сутки после начала культивирования,заменяют 5-о-микаминозилпротилонолидом, 20-гидрокси-о-микаминозилпротилонолидом или 20-оксо-о-микаминозилпротилонолидом, и каждое вещество добавляют по норме 15 мг наколбу, Спустя 3 сут после началакультивирования РТ 1.-448 А и РТЕВобразуются и накапливаются в культуральной среде в количествах, указанных в табл. 3. Выходы определяют экстрагированием культуральной средыбензолом, концентрированием экстракта, растворением культуральной среды бензолом, концентрированием экстракта, растворением осадка в метаноле, а затем по методике примера 1 - разделением и очисткой осадка тонкослойной хроматографией нагеле окись алюминия / двуокись кремния и сканированием (УФ-диапазон)на 232 нм.П р и м е р 5. В 5 мл метанола,подкисленного хлористоводороднойкислотой (рН 2) растворяют 100 мгоРТЕА и перемешивают при 42 С втечение 2 ч. Добавлением гидроокисинатрия рН реакционного раствора доводят до 9, и после этого растворэкстрагируют бензолом, Осадок растворяют в небольшом количестве метанола и подвергают тонкослойной хроматографии (силикагель, проявлениесмесью хлороформ(метанол)концентрированный водный аммиак 10/1/0,05).Продукт со значением М около 0,4собирают и концентрируют с получением45 мг продукта РТ 1.-448 С в виде белого порошка, Физико-химическая характеристика этого вещества приведена в табл. 1,П р и м е р 6. При комнатной температуре на протяжении ночи перемешивают 5 мл раствора 01 н, хлористоводородной кислоты/метанол (1/3),содержащего 20 мг РТЬА. Послеэкстрагирования бензолом повторяютметодику примера 5 с получением 8,4 мгРТ 1.-448 С,П р и м е р 7, Методику примера5 повторяют с тем отличием, что100 мг продукта РТЬВ растворяют в5 мл метанола, подкисленного хлористоводородной кислотой до рН 2, Такимобразом получают 41 мг продуктаРТЬв виде белого порошка, Физико-химическая характеристика этоговещества приведена в табл, 1,1344248 НО Х(СНз 1 Огде К - водород или ацетил;К " водород или микарозил,заключающийся в том, что штамм Бгерсошусев ашЬойасепв АТСС 15154 культивируют в жидкой питательной среде,содержащей источники азота и углерода и минеральные соли, в аэробныхусловиях, затем через 24 ч от началакультивирования в культуральную сре 20ду вводят протилонолид 5-о-микаминоЭ.зилпротилонолид, 20-оксо-о-микаминозилпротилонолид или 20-гидрокси-о-миканозилпротилонолид в концентрации 10-15 мг/100 мл культуральнойжидкости и выделяют целевой продуктобщей формулы (1), где К - микарозил, далее, при необходимости, целевой продукт подвергают гидролизуи получают целевой продукт общей формулы (1), где К - водород,рмула Способ пол учения антибформулы (1) ика -мак олида обще Таблиц теРТЬ448 О ракте РТЬА РТЬвико-хнмическая тика еементарный анализ, 7С 62,64,78 3,82 9,85 9,18 26 3,.2 3, 5 7 мпер атур а пл авлени С 108- 10 4" 115 8-10 Сдв Н Вх 1 Я 20 с 4 Нво ИяОа звН дБ,.ОО лекулярная формуНм Н 20 724 86 лекулярная масса(Сф 1, СН птическое вращенн Антимикробная активность антибиотиков-макролидов в сравнении со спирамицином представлена в табл. 4.Кроме того, изучают активность в отношении Мусор 1 авша с использованием известных методов (бумажный диск диоаметром 8 мм, 37 С, около 48 ч).Активность антибиотиков в отношении Масор 1 авша приведена в табл. 5.Полученные соединения могут быть использованы для лечения или борьбы с бактериальными или микоплазменными инфекциями теплокровных животных, а также людей.С этой целью новые активные ингре диенты смешивают со вспомогательными веществами и носителями, обычно применяемымив фармакологии и ветеринарии, Подобные носители и вспомогательные вещества могут быть аналогич ными применяемым для приготовления спирамицина или тилозина. Режимы дозировки также могут быть аналогичными используемым в отношении описанных антибиотиков.Ф о изобретенияИспытуемый микроорганизм В С Мусор 1 авна 8 а 11 зерИсиш КР29,2 30)1 АсЬо 1 ер 1 авша 1 а 161 асопРС 32 6 31 4 33 1 32 0 Составитель Г. СмирноваТехред А,Кравчук Корректор А, Зимокосов Редактор С. Пекарь Заказ 4840/59 Тираж 499 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5