Способ получения лактамного антибиотика

АмпицилинАзлоциллинАмоксициллинБакампициллинБензилпенициллинДиклоксацилинКарбенициллинМезлоциллинМетициллинОксациллинПивампи иллин П р и м е р 3, Получение антибиотика производили как в примере 1, но для извлечения антибиотика альбуминово-целлюлоэный сорбент брали в соотношении сорбент:нативный раствор 5:1000. Характеристика полученного антибиотика по выходу и чистоте представлена в таблице после примеров конкретного выполнения.П р и м е р 4. Антибиотик получали как описано в примере 1, но для удаления из нативного раствора балластных соединений альбуминово-целлюлозный сорбент брали в соотношении с нативным раствором 2;1000. Выход и степень чистоты полученного антибиотика в этом примере указаны в сводной таблице.П р и м е р 5. Получение антибиотика осуществляли как изложено в примере 1, но для удаления балластных веществ применяли альбуминово-целлюлозный конъюгат в соОтношении с нативным раствором как 5:1000. Характеристика препарата, полученного в этом примере конкретного выполнения, отражена в сводной таблице, помещенной после примеров конкретного выполнения.П р и м е р 6, Выделение и очистку антибиотического вещества, продуцируемогов питательную среду псевдомонадами данного вида, производили как изложено в примере 1. Для получения сравнительных данных, характеризующих выход и степень чистоты конечного продукта, параллельно из такого же объема нативного раствора получали антибиотик известным способом - сорбцией активированным углем с последующей десорбцией антибиотика с угля ацетоном, Сорбцию углем проводили при параметрах, аналогичных параметрам сорбции антибиотика альбуминово-целлюлозным конъюгатом, Параметры десорбции антибиотика с активированного угля ацетоном были адекватны таковым при десорбции этого антибиотика ацетоном с альбуминово-целлюлозного сорбента, Данные,характеризующие полученный известным5 способом антибиотик. представлены в сводной таблице.П р и м е р 7; Получение антибиотикапроизводили как в примере 1, а также известным способом - экстракцией н-бутанолом10 с последующим отгоном экстрагента и лиофилиэацией остатка. Характеристика антибиотического препарата, полученногоизвестным способом, приведена в следующей табл.2,15 Сравнительные данные по получениюантибиотика различными способами. Исходный материал в каждом примере: 10 лнативного раствора с активностью ЕД/мл,содержащих 10 тыс, ЕД (17 мг) антибио 20 тика.Указанные в примере 1 параметры сорбции альбуминово-целлюлоэным конъюгатом как балластных соединений, так иантибиотика, являются оптимальными. Из 25 менение их оказывает существенное влияние на выход целевого продукта (примеры 2и 5), степень его чистоты (пример 4) илипроводят к излишнему расходу сорбента(пример 3), т.е, к дополнительным затратам.30 Использование заявляемого способаполучения антибиотика, вырабатываемогоР. рзецбогпаИе, обеспечивает следующиепреимущества по сравнению с существующим способом;35 а) позволяет увеличить выход антибиотика в 2,5 и более раз;б) позволяет повысить чистоту конечного продукта без снижения его активности. 40 (56) Загпезоп 3. Е. Ап апбЫобс агою Р 1 еНегеИа ВВИпог.,3. Нуд. 1949, 47, р 142-145,Связывание белками сыво отки,2004590 21 Продолжение табл. 1 Таблица 2 Способ и тип ввоПриСтепень Примеси в Потери в % с отраПотери вЧИСТОТЫцелевогопроукта удалении ботанным балласт- нативным ных веществ раствором 34,7 1,0 64,7 0,6 1,0 32,0 33,3 34,7 б 4,9 1,0 0.4 34,7 50,0 0 20,0. 0,5 24,0 Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я оаживают формалином, из нативногораствора предварительно удаляют баллаСПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ф - ЛАКТАМНО- стные вещества посредством четырехкрат- ГО АНТИБИОТИКА, включающий отделе- нойсорбции альбуми- ново-целлюлозным ние микробной массы, извлечение конъюгатом в соотношении конъюгат: наантибиотика из нативного Раствора путем тивный раствор 4; 1000, затем нативный сорбции, элюцию его ацетоном с последу- раствор экстрагируют диэтиловым эфиром ющим отгоном растворителя, отличающий- при РН 7,00 и осуществляют извлечение ся тем, что, с целью увеличения выхода антибиотика путем двукратной сорбции таантибиотика и повышения его чистоты, пе-, ким же коньюгатом, после чего целевой ред отделением микробную массу обезза продукт лиофилизируют,2 3 4 5 6 Заявляемый, альбу- миново-целлюлозный сорбентТо жеТот же Тот же Тот же Известный с активированным углем Показатель Выход целввого продукта, % от его содержания в нативном дствО еИзобретение относится к медицине, а более конкретно к производству антибиотиков ф-лактамов, и может быть использовано при выделении из культуральной жидкости и очистке как антибиотика этого класса, синтезируемого Р,рзецбоааИе 1, так и других -лактамов, о которых известно, что они обратимо связываются с белками, не инактивируатся при рН 9,0 в течение времени, необходимого для доведения реакции нативного раствора до рН 9,0 и растворимы в ацетоне.Известно, что бактерии рода Рзецбоаопаз проявляют антагонизм в от.ношении многих видов микроорганизмов, обусловленный способностью к синтезу разнообразных по структуре антибиотических веществ в том числе р -лактамов (Еоцгп 1 ег,1 СЬааЬоп 1, 1 а аеИобозе ет ЬасИе бе 6/Ытаоге//СоИестоп бе 1 пзттцт Разтецг. Еб, Мед. - Раг 1 з, 1958; Айзенман Б.Е, Антибиотические свойства бактерий. - Киев: Наукова думка, 1973, - С. 21 - 40; Смирнов В.В Киприанова Е,А, Бактерии рода Рзецдоаопаз - продуценты новых антибиотиков//Пробл. изыскания и биотехнол. новых антиботиков. Всесоюз, конф., Москва, 22 - 24 июня 1982, Тех. докл, - Пущино, 1982. - С.54 - 55; Кожыбски Т., Ковшик-Гиндифер ЗКурылович В. Антибиотики. Происхождение, природа и свойства; В 2-х томах, - Варшава: Польск, гос. мед, изд-во, 1969, - Т,2, - С,905 - 916; Патент Великобритании А 61 К 21/ОО М 3505237, Способ получения антибиотиков при помощи Рзецбогпопаз роИапд 1; Патент Японии С 12 О 9/20 М 54 - 28473. Способ получения антибиотика Вй; Патент Великобритании С 12 0 9/20 М 2006750. Антибиотик ВИ, способ его получения и лекарственные препараты на его основе; Ланчини Д., Паренти Ф, Антибиотики. Пер. с англ, - М Мир, 1985, - С, 16, Смирнов В.ВКиприанова Е,А. Бактерии рода Рзецдовопаз - продуценты новых антибиотиков//Механизмы синтеза антибиотиков. Отв. ред-ры Г.К, Скрябин, С.М.Навашин. - М,; Наука, 1986, - С. 149- 161; Фомина И.П., Навашин С,М, Современные пенициллины - перспективы развития проблемы//Там же, - С, 92-102; Воробьева Л,И, Техническая микробиология, - М,: Издво Моск. ун-та, 1987. - С, 140 и другие),Большинство известных антибиотиков псевдомонад синтезируется 20 видами из более чем 200, описанных в литературе. Однако, хотя способность к продукции антибиотиков псевдомонадами известна давно, исследована в этом направлении лишь небольшая часть видов этого рода, а выделе собе его выделения и очистки, Джеймсон, как явствует из его сообщения, пытался выделить обнаруженный им антибиотик Р.рзецбоваИе 1 двумя способами, соответст вующими уровню научных значений тех лето выделении и о производстве антибиотиков. Но витморин оказался нестабильным, в нативном растворе и попытки Джеймсона выделить его окончились безрезультатно.55 Установлено, что витморин имеет значение в экологии, таксономии Р,рзецбоваИе 1 и дифференцировании ее от близкородственной Р.ваИе 1, т,е, данный антибиотик найдет применение в бактериологической диагностике инфекционных болезней, вы 5 10 15 20 25 30 35 40 ние антибиотиков проводилось лишь у нескольких видов,О способности патогенной псевдомонады Рзецбовопаз рзецбоваИе 1 (так называется этот микроорганизм в настоящее время. Прежние важнейшие синонимы; Вас 1 Ицз рзецбоааИе 1. 1913; Ре 1 ЛегеИа рзецЬова 11 е 1 1927; Ма 1 еовцсез рзецдоааИе 1, 1939; Р 1 е 1 ЛегеИа ЯЫтвог 1, 1949) продуцировать в окружающую среду антибиотик широкого спектра действия известно из сообщения 1,Е.Завезоп, 1949 (Ап аптЬо 11 с 1 гов Р 1 е 1 ЛегеИа ЮЫ 1 вог//,1.Нуц 1949. - К 47. - Р. 142 - 145). Этот источник информации был указан ранее в материалах заявки как прототип предлагаемого способа. Джеймсон назвал это антибиотик витморином, С тех пор ни зарубежом, ни в СССР никто не пытался получить данный антибиотик, так как продуцент его - сапрофит, патогенный для человека и животных, возбудитель мелиоидоза - опасной инфкционной болезни. По этой же причине низто не пытался определить к какому классу антибиотиков относится витморин, а также новый это антибиотик или уже известный, В настоящее время зарубежные исследователи не признают антибиотическую природу свойственного Р. рзецбоваИе 1 антагонизма против других микроорганизмов (Маукг Н, Рзецбовопаз аа 11 е 1 цпб Рзецбовопаз рзецбоааИе//НапбЬ. Ьай, 1 п 1 еИ. Т 1 егеп.- В,З, - епа, 1981, - Я. 111 - 153; Капа К Ое)з 1 г 11 егт Я. Веч 1 еа Рзецбовопаз рзецбоваИе 1 апб веИодоз 1 з, ай зреса ге 1 егепсе то Йе 1 п ТЬа 11 апб//,арап Меб,Яс 1,Во, - 1988. - Ч, 41. - Р. 123 - 157). В обзорной отечественной литературе об антибиотических веществах, синтезируемых псевдомонадами, работа Джеймсона не упоминается. Исследование патентной и научно-технической литературы по антибиотику Р.рзецбаааИе 1 с момента обнаружения его Джеймсоном, т.е. с 1949 года невыявило сведений об этом веществеи спо 2004590соптпцоцз геасОче ехгэсбоп о 1 ЬепсЬ эпд5 зываемых этими псевдомонадами. Оказавшийся более широким, чем указывал Джеймсон, спектр действия витморина(бактерицидно действует на грэмположительные и грамотрицательные микроорганизмы, в том числе возбудителей опасныхинфекций, э также на грибки), его устойчивость в кислой и в щелочной среде и нетоксичность может найти применение вклинической практике.Известны три способа выделения и очистки антибиотиков в том числе Р-лактамов из нативного раствора, применяющиеся какв отдельности, так и в комбинации друг сдругом: экстракция и ри разной величине рН в несмешивающиеся с водой органическиерастворители; сорбция при помощи различных сорбентов: активированного угля, силикагеля, сефадексов, кремнезема, ионообменных смол; осэждение сухимихлоридом натрия, сульфатом аммония, свинцовой, медной, железной, кобальтовой, никелевой, марганцевой, кадмиевой, ртутной солями, щелочами, молочной кислотой, новокаином и другими соединениями при различной степени насыщения (Бражникова М.Г. Принципы выделения и очистки антибиотических веществ//Успехи соврем, биологии, - 1950 - Т, 29, - МЗ, - С. 360-369; Гров Д., Рендалл У. Руководство по лабораторным методам исследования антибиотиков. Пер, с англ. - М.: ИЛ, 10; 1958, ГаузеГ.Ф. Пути изыскания новых антибиотиков, - М., Изд. АН СССР, 1958, Шемякин М.М., Хохлов А.С., Колосов М.Н. и др, Химия антибиотиков: В 2-х томах. - М.: Изд. АН СССР, 1961; Антибиотики/Герольд М., ВондрачекМ., Нечасек Я., Доскочил И. Пер. с чешск. - М,: Медицина, 1966; Кожыбски ТКовшикГиндифер 3., Курылович В. Антибиотики: В 2-х томах. - Варшава: Польск. гос. мед. издво, 1969; Навашин С.МБринберг С.А., Былинкина Е,С. Производство антибиотиков. - М,: Медицина, 1970; Егоров Н.С, Основы ученияя об антибиотиках. - М,: В ысш. ш к 1986; Пат, М 4440751, США; Пат М 4456592, США; Заявка ДЕ В 3304785 А 1, ФРГ; Пэт, С 12 О9/02, 13/00 М 52 - 18275, Япония; Пат. С 12 Р35/06 М 58-17594, Япония и многие другие).Известные способы в связи с сложностью и трудоемкостью процессов выделения и очистки антибиотиков, в том числеВ-лактамов, требуют для своего осуществления больших затрат труда, материалов, различных приспособлений, аппаратов иприборов, дополнительных реагентов, многозтапности(например, заявка С 12 Р 35/06 ЬЬ 58-17594, Япония; Репсл гесочег Ьу 1030 354045 50 р 11 от р 1 апс-зсэе е 9 црпзепт/йезсЫсе М МцПег Вччиег й. ет а 1 пзс, ТесЬп. Сает .1 ич. Наппочег, ОВ//3 Ецг. Сопдг, Вотесйпо 1 Мцпсйеп, 10 - 14 Зеро, 1984, - Чо 1.1, - Р.631-635; Авт, свид, С 12 Р 1/06 М 1589628 А и другие), так как не обеспечивают сами по себе высокий выход чистых антибиотиков с использованной массы нативного раствора.Все указанные недостатки известных способов присущи и способам, примененным Джеймсоном при попытке выделить из нативного раствора антибиотик витморин, продуцируемый патогенной Рзецбоаопаз рзецботэ 1 е (Р 1 еШеге 11 а ИВцпог - см, второй абзац на 2-ом листе данного описания). Джеймсон использовал два известных в то время способа: сорбцию на активированном угле с последующей элюцией (десорбцией) метанолом и ацетоном и экстракцию н-бутанолом. В принципе эти старые способы выделения и очистки Р-лактамов предлагается использовать и в настоящее время, например, в заявке С 12 Р 35/06 М 58-17594, Япония и в множестве других, а также в научно-технической литературе по выделению и очистке 3-лэктамов (пенициллинов и цефалоспоринов),Однако пропускание нативного раствора через колонки с активированным углем приводит к плохой сорбции антибиотика в результате забивания пор сорбента балластными компонентами нативного раствора, что в результате практически приводит к низкому выходу целевого продукта, большим потерям его и делает выделение и очистку искомого вещества невозможными без дополнительных приемов, трудовых и материальных затрат, предотвращающих это явление или компенсирующих его. Кроме этого, большинство Р-лактамов и, как показали наши опыты, в том числе витморин слабо связываются с другими обычно используемыми или предлагаемыми в патентах сорбентэми: силикагелями, сефадексами, ионообменными соединениями различной структуры, кремнеземом, т.к. Р -лактамы не образуют прочных химических связей со всеми сорбентами, достаточных для выделения. В результате сорбция Р-лактамных антибиотиков известными сорбентами малоэффективна и трудоемка,Бутаноловый экстракт витморина, как и других Р -лактамов, например, ампициллинэ, кэрбенициллина, кефзола плохо отделяется от нэтивного раствора. что также приводит к низкому выходу целевого продукта и к загрязнению его балластными веществами. Экстракция этих антибиотиков5 10 15 20 25 30 40 50 55 другими органическими растворителями, в том числе, например, диэтиловым эфиром при предварительном подкислении натив- ного раствора до рН, равного 0,1: 0,5; 1,0;2,0; 3,0; 4,0 и тд. до рН 7,0 при одно- и трехкратном использовании экстрагента давала в наших условиях низкий выход антибиотика, незначительно зависимый от количества повторных экстракций, Выход продукта, близкий к 50; от его содержания в нативном растворе, обеспечивала только 10-кратная последовательная экстракция эфиром при рН 0,1 нативного раствора. Для выделения витморина экстракционным способом требовалось наличие многообъемной вытяжной вентиляции, больших объемов экстрагента и многократных повторных экстракций, специальных противопожарных мероприятий,В процессе работы по получению витморина опробованы практически все известные способы выделения антибиотиков, указанные при характеристике аналогов. В результате антибиотик витморин был получен экстракционным(диэтиловый эфир при рН 0,1) и сорбционным (на активированном угле) способами с очень низким выходом, Изучение физико-химических и биологических свойств витморина, его функциональных групп и хромофоров позволило идентифицировать его как смесь шести производных о -лактама цефалоспориновой группы с необычным для ф-лактамов свойством-активность против грибков, в том числе возбудителей глубоких микозов.Анализ патентной литературы по способам выделения и очистки ф -лактамов не выявил ничего нового по сравнению с теми способами, которые были известны и которые мы уже использовали для выделения и очистки витморина, Низкий выход конечного продукта, достигаемый при помощи известных пособов (см, таблицу после примеров конкретного выполнения в материалах заявки), побудил к поиску способа, простого, менее трудоемкого, не требующего дополнительного оборудования,а главное - обеспечивающего более высокий выход антибиотика и повышение его чистоты. Кроме того, необходимо было найти методический прием, обеспечивающий из-за патогенности продуцента витморина для человека и животных полную безопасность культурального бульона этой псевдомонады при работе с ним по выделению и очистке продуцируемого этим микроорганизмом антибиотика, Этот методический прием для обеззараживания культурального бульона должен был по логике быть полезным для самого процесса выделения и очистки витморина, т.е, каким-то образом сочетаться с последующими манипуляциями .по получению антибиотика. Использовавшийся для обеззараживания бульонной культуры продуцента витморина хлороформ не сочетался с выделением антибиотика, так как витморин в хлороформе не растворим,Согласно способа, примененного Джеймсоном, нативный раствор получают после обеззараживания бульонной культуры Р,рзецбогпае путем быстрого, в течение нескольких минут (из-за термолабильности витморина в жидкости) прогревания ее до 100 С или в течение 10 мин при 75 С и отделения бакмассы центрифугированием или зейтцфильтрацией,Однако это практически невозможно осуществить быстро с большими объемами бульонной культуры, необходимыми для выделения и очистки антибиотика, т.к, требуется масштабного соблюдения режима безопасности в процессе работы, что требует в свою очередь специальной защитной одежды, специального оборудования, аппаратуры и дополнительных производственных площадей для их размещения, т.е. больших материальных затрат,Кроме того, такую манипуляцию для получения нативного раствора невозможно осуществить быстро из-за большой тепло- емкости больших объемов культуральной жидкости, а это отрицательно влияет на активность целевого продукта.Известны способы обеззараживания бульонных культур патогенных микроорганизмов (например, особенности методических приемов при работе с возбудителями инфекционных болезней человекаигруппы патогенности бактериальной этиологии: Практическое руководство/Уралева В,С Гулида М.МЛебедева С.А. и др. - Ростовна-дону, 1989, - С,75; Инструкция о противоэп идем ичес ком режиме работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителями инфекционных болезней-групп. - Саратов,1979, - С, 59-83),Однако в этих руководствах, а также в патентной и научно-технической литературе нет сведений, характеризующих влияние известных деэинфектантов на активность антибиотиков класса ф-лактамов при контакте с ними.Известно, что все ф-лактамные антибиотики имеют в своей структуре свободную карбонильную группу С=(" в ф-лактам 2004590 1010 ном кольце (Химия антибиотиков/Шемякин М,М., Хохлов А,СКолосов М.Н. и др. - М,; Изд. Ан. СССР, 1961; Франклин ТСноу Дж. Биохимия антимикробного действия; Пер, с англ. - М.: Мир, 1984, - С.56 и другие), а антибиотическая активность их связана с лабильностью лактамного кольца, в частности с реакционноспособностью амидной группы, замыкающей это кольцо, которая состоит иэ карбонильной группыуглерод которой связан с азотом бывшей аминогруппы (Указанные выше монографии; Якубке Х. - Д. Ешкайт Х, Аминокислоты, Пептиды. Белки. Пер. с нем, - М.: Мир, 1985, -С.298), .Известно, что свободная карбонильная группа С=0 сильно поляризована,что обусловливает большую реакционную способность органических соединений, содержащих карбонильную группу; Для этой группы характерна реакция присоединения (Терней А, Современная органическая химия; В 2-х томах. Пер. с англ. - М.: Мир, 1981.- Т.2. - С. 5-6. 26-27; Хомченко Г.П. Химия . (для подготовительных отделений): Учебник, - М.; Высш. шк, 1988. - С. 325-326; Практикум по органической химии, Синтез и идентификация органических соединений, Под ред, О,Ф.Гинзбурга и А.А.Петрова.- М,; Высш. шк., 1989, - С. 124-127 и другие).Известно, что карбоксильная группа, имеющаяся в боковых цепях не только ф-лактамных антибиотиков, не проявляет . характерные свойства .карбонильной группы (Они же. Там же; Гончаров А.И., Корнилов М.Ю Справочник по химии. - Киев: Вища шк 1977. - С. 120 и другие).Известно, что наиболее обширным классом соединений, которые вступают в реакцию присоединения с веществами, содержащими карбонильную группу, являются производные аммиака, Продукт реакции этого типа - имин или основание Шиффа типа (:Щ достаточно устойчив,чтобы его можно было выделить (Терней А. Там же. - С. 27-28; Марч Дж. Органическая химия, Реакции, механизмы и структура, Углубленный курс для университетов и химических вузов: В 4-х томах. Пер. с англ, - М.: Мир, 1987. - Т,З, - С.340 - 342).Известно, что вещества с реакционноспособной карбонильной группой - альдегиды и кетоны непосредственно реагируют со свободными аминогруппами (производное 20 25 30 35 40 45 аммиака) белка также с образованием относительно стойких оснований Шиффа (Полевая О,Ю., Ковалев И,Е. Принципы синтеза конъюгированных антигенов//Хим, - фарм. ж. - 1978. - Т. 12. - В 2. - С, 8-22 и другие).На основании этих известных фактов и их сопоставления предположили, что для флактамов, в структуре которых. имеется свободная карбонильная группа в амидной связи р -лактамного кольца, должна быть характерна реакция присоединения, свойственная альдегидам и кетонам, т.е, эта группа у ф-лактамных антибиотиков должна быть сильно поляризована и, вследствие этого, реакционноспособна.Известно, что связывание белками многочисленных лекарственных веществ обусловлено взаимодействием полярных групп этих веществ с полярными или ионными группами белков(Гауровиц Ф. Химия и функции белков: Пер. с англ. - М,; Мир, 1956. - С. 281).Известно, что большинство антибиотиков связывается в различной степени с белковыми веществами (Гров Д., Рендалл У. Руководство по лабораторным методам исследования антибиотиков: Пер. с англ. - М.: Медгиз, 1958 - С. 18).Известно также, что это свойство антибиотиков наиболее выражено у ф-лактамов (Фомина И.ПНавашин М,М. Современные пенициллины - перспективы развития проблемы//Механизмы биосинтеза антибиотиков. Отв, ред-ры Г.К.Скрябин, С.М.Навашин, - М.: Наука, 1986, - .С, 92-102 и др.). Для иллюстрации этого свойства р-лактамов приводят свободную таблицу, характеризующую процент связывания белками сыворотки крови р -лактамов группы пенициллинов, составленную на основании данных табл.1 и 2, приведенных в обзоре Фоминой И,П. и Навашина С.М., на который только что сделали ссылку. Комплексирование белков с различными биологически активными компонентами в процессе жизнедеятельности органиэма - широко известное явление. Наиболее реакционноспособным белком крови является альбумин (Гауровиц Ф. Химия и функции белков: Пер, с англ. - М.: Мир, 1965, С. 178, 218, 280 и другие), У больных, получавших большие дозы пенициллина на электрофореграммах сывороточных белков появляется быстрый компонент альбумина, .исчезающий из крови после прекращения терапии, Этот феномен проявляется 1 и чИго при добавлении к сыворотке крови 500000 Ед/мл натриевой соли пенициллина (Агчап5 10 15 20 25 30 45 50 О,Я В 1 шпЬегц В,5., МеагОп 1.//СПп. СЫгп. Ас 1 а. 1968. - Ч. 22. - Р, 21 - 25),Известно, что молекула пенициллина или цефалотина образует соединение амид- ного типа между карбонильным атомом углерода - лактамного кольца и е МН 2-группой остатков аминокислоты лизина молекулы альбумина. Этот процесс не является ферментативным, Образовавшаяся ковалентная связь обладает довольно значительной прочностью( еч 1 пе В,В. Меа. Епце. З,Мео, - 1966, Ч. 275, - Р. 1115), Диализ уменьшает количество связанного альбумином пенициллина или цефалотина, .т.е. эта связь является обратимой. Фермент /3-лактамаза не гидролизует 3-лактам, соединенный с альбумином (это подтверждают и результаты наших опытов),.В процессе излучения физико-химических свойств антибиотика витморина, полученного изестными способами (сорбцией на активированном угле и экстракцией диэтиловым эфиром при рН 0,1), было установлено, что это антибиотическое вещество способно связываться с сывороточным альбумином, в качестве которого использовали сначала альбумин, который мы выделяли из нормальной лошадиной сыворотки (дешевое сырье), а затем коммерческий бычий сывороточный альбумин (БСА). В дальнейшем выявили, что 4 О-ный раствор БСА способен связывать 87,5 О витморина от количества его в одном литре исходного раствора.Известно, что молекула альбумина, например, БСА, содержит 60 свободных Я-аминогрупп аминокислотных остатков лизина (ОоЫХагЬ Я,В. Вос 3 пч. ЫорЬуз. Аста. - 1970, Ч. 200, - Р, 1 - 4, Ковалентное связывание этаперазина с белком для получения антител, нейтрализирующих физиологическое действие этаперазина/Полевая О.Ю., Башарова Л,АШайдров В,ВКовалев И, Е,//Хим,-фарм. ж, - 1976, - Т, 10 - В 9. - С, 15 - 19). Эта величина теоретически характеризует сорбционную емкость альбумина в отношении связывающихся с ним 3-лактамов(пенициллинов, цефалоспоринов,монобактамов и всех других ф-лактамных антибиотиков как уже известных, так и открытых в будущем). Практически, как показали результаты проведенных опытов, сорбционная емкость молекулы сывороточного альбумина в отношении 3-лактамов зависит от наличия в молекуле антибиотика в его боковых цепях других радикалов и их величины, создающих пространственные трудности стерические затруднения -Марч Дж, Органическая химия. Реакции, механизмы и структура, Углубленный курс для ун-тов и химич. вузов: В 4-х томах; Пер, с англ, - М,: Мир 1987) для сближения и последующей реакции между карбонильным углеродом 3 -лактамного кольца того или иного 3-лактама и свободными к-аминогруппами молекулы альбумина, По этой причине все Р -лактамные антибиотики связываются с молекулой альбумина с разной интенсивностью. Поэтому каждый Р -лактам характеризуется конкретным, только ему свойственным процентом связывания(что видно из приведенной выше таблицы) с сывороточными белками, а именно с альбумином.Известно также что деэинфектант формальдегид модифицирует функциональные группы белка, Сразу же после добавления формальдегида в раствор белка происходит быстрое его взаимодействие с аминогруппами белка, в частности альбумина (Гауровиц Ф, Химия и функции белков: Пер. с. англ. М.: Мир, 1965, - С. 179 - 180; Оценка различных количественных методов определения белков, нативных и ообработанных формальдегидом/Кондакова Н,В., Божко Г,В Коржова Л.П., и др,//Вопросы мед, химии. - 1983, - Т.1. - В.2. - С,134 - 140). При этом местами атаки формальдегида в белках могут быть первичный и вторичный азот алифатических аминокислотных остатков, в том числе остатков лизина, азот пептидной связи, азот имидазольного кольца гистидина и индольного - у триптофана, Н- и ОН-группы боковых цепей, а также по реакции нуклеофильного замещения о-положение фенольного кольца тирозина и а-С-атом индольного кольца триптофана, В результате модификации белка формальдегидом "разрыхляется" пространственная организация белковой молекулы и становятся доступными другие ее функциональные группы. Модифицированный формальдегидом белок, в том числе альбумин может быть затем регенерирован диализом (Они же.Там же),В опытах, проведенных с беззараженным формальдегидом культуральным бульоном Р,рзеоЬощаИе, содержащим витморин - смесь дериватов Р-лактамов цефалоспориновой группы, было обнаружено, что альбумин после контакта с содержащимся в нативном растворе формальдегидом, лучше, интенсивнее связывает содержащиеся в растворе балластные вещества, от которых было практически невозможно освободить полностью целевой продукт при сорбции его активированным углем или при экстрации его органическими растворителями, В результате этой серии опытов было установлено, что балластные соединения40 45 50 55 полностью удаляются из нативного раствора бычьим сывороточным альбумином, модифицированным формальдегидом при четырехкратной сорбции их альбуминовоцеллюлозным конъюгатом, взятым в соотношении к нативному раствору 4:1000 при рН 9,0, При этом искомый Р -лактамный антибиотик витморин практически не связывался с модифицированными формальдегидом функциональными группами белка, что предотвращало потери целевого продукта при получении его предлагаемым способом и тем самым повышало в несколько раз его выход.Таким образом, полученные в этих опытах результаты позволило испольэовать формальдегид в качестве средства, обеззараживающего культуральный бульон патоге н ного и роду цента /3-лактамных антибиотиков Р,рзеоЬогпа 11 е, средства, консервирующего нативный раствор и тем самым предотвращающим частичную инактивацию в нем витморина, которая происходила в ходе длительной сорбции его активированным углем при пропускании раствора антибиотика через колонки с углем, а также модификатора функциональных групп альбуминового сорбента, способствующего своим воздействием на функциональные группы альбумина в совокупности с доведением реакции нативного раствора до рН 9,0 резкому повышению масштабности связывания балластных соединений с альбумином сорбента, что играло важную роль в получении чистого целевого продукта. Последующую сорбцию самого витморина проводили после доведения рН освобожденного от балластных соединений раствора антибиотика, до 7,0 и удаления из раствора остатков формальдегида экстракцией диэтиловым эфиром (чтобы предотвратить возмокную модификацию формальдегидом свободных аминогрупп белка сорбента),В качестве средства, десорбирующего связавшийся с альбуминовым сорбентом ф-лактам, были испытаны разные органические растворители, В результате в качестве десорбента был выбран ацетон, который, являясь простейшим кетоном, имеет в своей структуре как и Р-лактамы реакционноспо собную карбонильную группу, более активную, чем у Р-лактамов, и, видимо, поэтому вытесняет последние иэ аддукта. образующегося в результате реакции присоединения к карбонильной группе лактамных антибиотиков аминогруппы белка. Такой механизм реакции между продуктами реакции присоединения, свойственной альде 5 10 15 20 25 30 35 гидам,метилкетонам и некоторым циклическим кетонам (а лактамы можно рассматри-. вать по своей структуре и как циклические кетоны), и другими альдегидами и кетонами описан в химической литературе (напри. мер, Терней А, Современная органическая химия: В 2-х томах, Пер. с англ, - М,: Мир, 1981, - Т.2. - С, 25 - 26 и другие), Кроме того, ацетон хорошо растворяет многие 3-лактамы, легко отгоняется под вакуумом при 30 - 32 С и менее ядовит по сравнению с другими использованными растворителями. Преимуществом ацетона является и тот факт, что в нем не растворяются аминокислоты нативного раствора, которые в принципе могут быть захвачены массой сорбента при манипуляциях с ней при получении Р-лактамов. Это свойство ацетона, известное из справочной литературы по химии, положительно сказывается на чистоте целевого продукта.Альбуминово-целлюлозный сорбент, а не свободный альбумин, использовали для получения Р -лактамных антибиотиков для того, чтобы белок, связавший антибиотик, можно было легко отделять от раствора, содержащего антибиотическое вещество. Эта задача была решена путем изготовления и применения водной взвеси альбуминовоцеллюлозного конъюгата. Конъюгат готовили на основе известного факта связывания карбонильных групп диальдегидцеллюлозы с аминогруппами альбумина и стабилизации образовавшейся между белком и целлюлозой ковалеткой связи боргидридом натрия,Все зти известные факты послужили основой для разработки нового способа выделения антибиотиков, имеющих Р-лактамное кольцо в структуре своей молекулы.Таким образом, в результате проведенных исследований был разработан способ получения Р -лактамных антибиотиков, позволяющих значительно увеличить выход и чистоту целевого продукта, в том числе антибиотика витморина, продуцируемого Р.рзео бова е. Способ дешевый. т, к. может быть осуществлен с использованием альбу- мина животных, для получения которого может быть использовано дешевое сырье - кровь животных, забиваемых на мясокомбинате любого крупного города.В принципе предлагаемым способом можно получать любые Р -лактамы иэ бульонной культуры любого их продуцента, т,к. все ф-лактамы образуют обратимую химическую связь с е-аминогруппами альбуми2004590 16 15 люлозой, отмывки готового сорбента от следов реактивов водой,Для контроля за очисткой антибиотикаот балластных соединений, связывающихся5 при рН 9,0 в присутствии формалина с альбуминово-целлюлоэным сорбемтом, послекаждой сорбции их и удаления вместе с сорбентом, отбирали пробы жидкости одинакового обьемэ, например 5 мл,10 нейтрализовали их концентрированной соляной кислотой и три раза экстрагировалииз них диэтиловым эфиром остатки формальдегида. Затем пробы лиофильно сушили и сухой остаток растворяли в 0,1 мл15 дистиллированной воды. У полученных растворов проверяли активность в отношениимикробов-индикаторов данного антибиотика: Зт.авгцв 209 или У,резт 1 з ЕВ НИИЭГметодом диффузии в агар в лунках. При уче 20 те результатов через 24 ч обращали внимание на наличие или отсутствие в зонахимгибиции роста - 1 тест-микробов (см. ниже) окрашенной зоны -2, которую образуютбалластные соединения непосредственно25 вокруг лунки - 3. При этом констатировали,что после каждого удаления балластных веществ диаметр окрашенной зоны уменьшался, а после четвертой сорбции- исчезал,как это показано ниже; Вид эон подавления роста Зт.ацгецв 209 нативным раствором - НР после каждого удаления из него балластных соединений1" Ой Яй гидридом натрия химической связи, обре зовавшейся между альбумином и целПосле извлечения иэ нативного раствора балластных соединений, его готовили для связывания эльбуминово-целлюлозным коньюгатом только антибиотика. Для этого 35 раствор нейтрализовали соляной кислотой и трижды экстрэгировали диэтиловым эфиром для удаления остатков формальдегида. Антибиотик извлекали при помощи 40 двух сорбций коньюгэтом при тех же параметрах, что были изложены выше. Сорбент с связавшимся с ним антибиотиком быстро отмывали на центрифуге водой от остатков нативного раствора, Антибиотик десорби ровали ацетоном, который затем отгоняли. Жидкий остаток после отгона ацетона лиофилизировали. У конечного продукта - сухона независимо от того каким продуцентом синтезированы Р-лактамные антибиотики.П р и м е р 1, Выращенную в бульоне Хоттингера рН 7,5-7,6 пятисуточную культуру Рзецбоеопав рзеобоеаПе 1 обеэзараживали добавлением фоомалина до 1-мой конечной концентрации с экспозицией не менее 12 ч при комнатной температуре. Нэтивный раствор отделяли от микробной массы декантацией.Для удаления балластных соединений из нативного раствора его подщелэчивали, стремясь к наименьшему разбавлению, при помощи концентрированного водного рас.твора гидроксида натрия до рН 9,0 и четыре раза сорбировэли альбуминово-целлюлозным коньюгэтом из расчета 4 г его по сухому весу ма 1 л, каждый раэ выдерживая смесь сорбента с раствором 24 ч при комнатной температуре, периодически (5-6 раз в течение рабочего дня) перемешивая ее.Альбумимово-целлюлоэмый сорбент в виде водной взвеси готовили путем коньюгациии в щелочной среде коммерческого бычьего сывороточного эльбумина с взвесью окисленной перйодатом в альдегидную форму порошковой коммерческой или полученной иэ хлопковой ваты химически чистой целлюлозы, стабилизации борго препарата антибиотика определяли вес, который характеризовал выход антибиотика, и проверялась активность и степень чистоты.Активность растворов, содержащих антибиотик, определяли в стандартных условиях методом диффузии в агар в лунках как изложено выше. Величину активности выражали в условных единицах, предложенных ВНИИА для расчета активности антибиотиков (Навашин С.М., Фомина И.П. Справочник по антибиотикам, 3-е иэд. - М,: Медицина, 1974, - С.57), т.е, принимали, что раствор антибиотика с активностью 1 ЕД/мл образует зону задержки роста тест- микроба диаметром 17 мм. Серией опытов было установлено, что активность 5-суточного культурального бульона штамма Р.рзецбова 11 е 1 5 У 361 М-8. использованг "4 К 12,3 19 Со г 2 "4 к 11 пС 40 С, Ч - , - 710 45 50 55 ного в качестве продуцента антибиотика, выраженная в мм диаметра зон ингибиции роста тест-микроба Яс,ацгецз 209, колебалась в пределах 16 - 18 мм и равнялась в среднем 17 мм, После разведения культурального бульона в 2 раза, активность его снижалась в среднем до 12 мм. При последующем двукратном разведении культуральный бульон не обладал активностью. Исходя иэ этого, принимали, что нативный культуральный бульон содержит антибиотик в концентрации 1 ЕД/мл. а разведенный вдвое - 0,5 ЕД/мл,Для определения активности растворов антибиотика в единицах использовали принцип упомянутого выше метода, согласно которому строили стандартную кривую зависимости диаметра эон подавления роста Б,ацгецз 209 от активности испытуемых растворов в единицах. Угол наклона стандартной кривой характеризовался разностью диаметров эон от двукратных концентраций антибиотика, т,е. эон, образуемых цельным культуральным бульоном и разведенным в 2 раза.Для выявления концентрации раствора антибиотика, обеспечивающей образование принятой единицей активности оптимальных зон задержки роста тест-микроба, использовали известную формулу Купера (Соорег К.Е.и; Апа 1 цт 1 са 1 М 1 сгоЬ 1 ооду. - Меа. огМ, 1962 - Р. 1-85), связывающую размер в см зоны подавления роста тест-микробов с начальной концентрацией антибиотика в лунке в мкг/мл: где: г - радиус эоны в см,к - коэффициент диффузии, см /ч;т - время диффузии до учета результатов, ч;Со - концентрация препарата, мкг/мл; Сс - концентрация препарата в лунке через время с;1 и - натуральный логарифм. Принимая во внимание, что 1 п а = 2,3 19 а (Краткий справочник химика. Составитель В.И.Перельман. 6-е изд, - М.: ГХИ, 1963, - С. 570), а величиной Ст можно пренебречь, т.к. эа 24 ч, использовавшиеся в качестве стандартного времени при определении диаметра зон ингибиции, содержимое лунки полностью диффундирует в пластинку агара, и в лунке ничего не остается, формулу Купера упростили, а затем преобразовали следующим образом: 10 15 20 25 30 35 2Отсюда 19 Со4 Ь 2,3 где г - радиус эоны, см;Ь - высота стандартной пластинки агара, см, в которой сделана стандартная лунка.Величину Со находили по таблице анти- логарифмов.Оказалось, что активность в 1 ЕД/мл соответствует концентрации антибиотика в 1,7 мкг/мл, Найденное весовое выражение 1 единицы активности препарата использовали также для характеристики степени чистоты (С,Ч,) конечного продукта, Для этого готовили его раствор в воде, содержащий 1,7 мкг/мл полученного антибиотика, и определяли методом диффузии в агар в лунках диаметр в мм вызываемой данным раствором зоны ингибиции роста тест-микроба, При образовании зоны диаметром 17 мм, препарат считали чистым, т.е. степень чистоты его характеризовали единицей или как 100 , При образовании меньших по диаметру зон испытуемым раствором препарата чистоту его оцени вали по формуле: ДЗор. - ДЛ/ДЗед - ДЛ, где ДЗпр - диаметр эоны в мм, образовавшейся поддействием испытуемого раствора препарата; ДЗ 1 ед = 17, т,е. зто диаметр зоны, сформированной под действием раствора антибиотика с концентрацией 1,7 мкг/ал, активность которого равна 1 ЕД/мл; ДЛ - стандартный диаметр лунки, всегда равный 7 мм. После подставления уже известных значений формула имела следующий вид Полученные результаты приведены в сводной таблице после примера 7,П р и м е р 2. Выделение и очистку антибиотика производили как изложено в примере 1, но после удаления из нативного раствора балластных соединений с последующим доведением соляной кислотой реакции раствора до рН 7,0 и удаления остатков формальдегида экстракцией диэтиловым эфиром в соотношении 1:3, извлечение антибиотика производили двукратной сорбцией альбуминово-целлюлозным конъюгатом, который брали в соотношении коньюгат; нативный раствор 2:1000. Характеристика полученного препарата антибиотика представлена в таблице после примеров,