Способ получения термически устойчивой бактериальной амилазы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1 Ю (11) ОП Е ИЗОБРЕТ ПАТЕН УДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ(71) Набиско Брэндз Инк (08)(56) Бечина Е,М Логинова Л.Г.,Гернет М,В, Отбор продуцентов амилолитических ферментов среди термофильных микроорганизмов. - Прикладнаябиохимия и микробиология, 1982, 18,В 5, 640-647.Гоагу Ч,М Ке 11 у С.Т. Аау 1 авев, ашу 1 оя 1 исовЫавев апй ге 1 агейя 1 псапавев. - М 1 сгоЬ. Епгушев апс 1В 1.осопчегв, 1,опйоп е,а 1980, 115170.Патент Англии У 1296839,кл, С 12 0 13/10, опублик, 1971.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕРМИЧЕСКИ УСТОЙЧИВОЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ а, - АМИЛАЗЫ(57) Изобретение относится к способам получения ферментных препаратов (-амилазы и может быть использовано в химической, ферментной или пищевой промьппленности. Цель изобретения - повышение активности 1 -амилазы,Сущность изобретения заключается в том, что в качестве продуцента термостабильной-амилазы используют штамм Вас 1.11 пв 1 сЬепйогшв АТСС 39326, который культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные компоненты и воду при рН 5,5-8,0, причем в качестве источника углерода предпочтительно используют лактозу в концентрации 5-15 мас.7 Изобретение позволяет получить , -амилазу с активностью 1500-2000 ликфон-мл или 10000 БКВ единиц/мл после 72 ч культивирования продуцента. 1 з.п. ф-лы, 1344247Изобретение относится к способамполучения ферментного препарата1-амилазы иможет быть использовано в промыгпленности моющих средств и приконверсии крахмала в водорастворимые углеводы в химической, ферментной или пищевой промышленности,Цель изобретения - повьшение активности-амилазы.Способ заключается в том, что вкачестве продуцента термостабильной г -амилазы используют штамм Вас 11 ггв 1.с 1 гепНоггпз АТСС 39326, который культивируют в питательной среде, содержащей в качестве источникауглерода предпочтительно лактозу вусловиях рН среды 5,5-8,0 при аэрировании иперемешивании. Целевой про, дукт выделяют известными методами,Штамм Вась 11 цз 11 с 1 гепНогппз хранится в Американской коллекции типовых культур микроорганизмов под номером АТ СС 39326.Испытываемые природные источники-амилазы высевают на среду, содержащую крахмал, цитрат, фосфат аммонияаи небольшие количества Са и Мяи выращивают при 41 С, Культуры исследуют на наличие осветленных зонвокруг колоний на агаре Культуры,характеризующиеся большими зонами,распыляют на большие пластины с крахмало-агаровой средой, содержащейагаровую среду с 0,57 гелеобразногокрахмала Линтнера, 0,57 дрожжевогоэкстракта, 0,27 цитрата натрия,0,5% фосфата аммония, 0,57 сульфатамагния и 0,008% СаС 1 НО, 1,57 агара при рН 7, и вьгращивают при 40 Св течение 24-48 ч, Снова собираюткультуры, продуцирующие большие осветленные зоны и сравнивают с контрольной культурой В,1 ьсггепЫопп 1 з.Культуры, выращенные в шейкерахв течение 5-8 сут, испытывают на альфа-эмилазную активность в диапазоне150 разжижений/мл. Затем культуры,проявляющие адекватную активность,отбираютдля проверки амилазной акотивности при 87 С,Полученный штамм имеет типичныехарактеристики В,1 ьсЬепЫопп 1 з, т,еявляется грамположительным, спорообразующим микроорганизмом, способнымк анаэробному росту и использующимпропинат аэробно. Особенностью этогоорганизма является то что его-амилаза не требует экзогенного 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Са для активности при 87 С атакже его необычайно высокий уровеньактивности фермента при этой температуре,Сравнение коммерческого ферментаКлинтона и предлагаемого при 80 ио95 С показывает, что для:полученияжелаемого уровня декстринизации заопределенное время требуется меньшееколичество фермента,ферментацию обычно осуществляютв течение 2-6 дней при 25 - 55 С, сиспользованием обычных усвояемых источников углерода, азота и другихпитательных веществ, Подходящими источниками углерода являются углеводы(лактоза, глюкоза и крахмал) или ве-,.щества, содержащие углеводы, такиекак соя, кукурузная мука и т,п, иих смеси, Количество углевода можнозначительно изменять 1 - 25 мас /об,предпочтительно от 5 - 15 мас7/об.Наиболее предпочтительным источником углерода является лактоза, поскольку в этом случае достигаютсянаилучшие показатели ферментной активности. Содержание лактозы в питательной среде 1 - 20 мас,7/об, пред.почтителен диапазон 5 - 15 мас,7/об,Лактозу можно использовать либо в качестве единственного источника углерода, либо в комплексе с другими источниками, такими как сыворотка исоевая мука, при этом концентрацияпоследних должна составлять не менее5 мас,%/об.Источник азота может быть органическим или неорганическим, напримеррастворимые нитраты или соли аммония.Источниками органического азота могут быть дрожжевой экстракт, кукурузный экстракт, мука земляного орехаи т,п,Иикроорганизм выращивают в питательной среде в аэробных условиях,которые обеспечивают путем аэрирования бродильных сосудов, обычно прискорости один объем воздуха на объемсреды,фермент вьщеляют из реакционнойсреды после достижения требуемыхуровней ферментной активности известными способами, например осаждением фермента с использованием известных осадителей, таких как сульфатнатрия или несмешиваемые с водой органические растворители ацетон илиэтанол, В результате центрифугирова 1344247ния или фильтрования осадка с последующей его сушкой получают очищенный. твердый ферментСпособ осуществляют следующим об 5 разом.Вас 111 пз 11 сЬеп 1 йогшз АТСС 39326 сеют штрихом на пластинку крахмального агара ПЫсо и выращивают при 40 С в течение 18 ч, 10Суспензией клеток инокулируют бульон следующего состава, Е: дрожжевой экстракт 0,5; триптон 0,5; КНРО 0,1; Э-глюкоза 0,1. 350 мл на колбу емкостью 1 л. Культивируют 15опри 40 С в течение 1-2 дней при скорости вращения 200 об/мин, на встряхивателе Брансвик С - 50 (2 в орби).Все содержимое колбы используют в качестве прививочного материала в объеме 3150 мл среды, имеющей следующий состав, 7.: лактоза 10; К НРО 1,4 (лактозу и К,НР 04 обрабатывают в автоклаве отдельно от других компонентов); КН РО 0,6; (МН,) 80 0,6; 25 цитрат натрия 0,3; соевая мука 3,0; СаС 1. 2 Н 0 0,05; 1,0 мл МА 2 цДР 6000 - пеногаситель. Исходное значение рН 6,8 - 7,0. Среду стерилизуют в автоклаве вотечение 60 мин при 121 С, общее количество 6,8 кг,Для оптимального получения ( -амилазы рН культуральной среды долженбыть ниже 8,0, но не ниже 5,5,Для контроля за возможным вспениванием при размножении предусмотренпротивовспениватель Ма 2 иДР 6000,Условия ферментации: скорость перемешивания 600 об/мин, температура9культивирования 40 С, аэрация среды1 л об/об, воздуха, рН через 72 ч6,5 - 7,0,Измерение активности фермента 45-амилазы осуществляют с помощью .стандартной технологии. Один иэ такихметодов представляет собой видоизмененный метод Вохлегермута, при котором активность определяют во временивываривания, необходимого для изменения окраски, характеризующего определенную стадию декстринизации крахмала. Метод тарируют так, что кон-.центрацию амилазы можно рассчитатьнепосредственно в ликфонах на грамм.Аналитическое определение содержания-амилаэы в ликфонах производятследующим образом, Фиксируют. время и разбавление позавершении реАкции и рассчитываютактивность в ликфонах на грамм или1 мл.Расчет ферментативной активностипроизводится по следующей формуле: 1140 Ликфоны (или мл) Х растворение Фактический вес (или объем в мл)пробы, Х - время декстринизации,мин. Готовят пробу раствора с использованием в качестве растворителя и разбавителя 0,025 М раствора СаС 1 так, что для 5 мл готового разбавленногораствора время декстринизации составляет 10 мин. Если приблизительная активность ферментного препарата не известна, надлежащий размер пробы и/или степень разбавления необходимо определить экспериментальным путем.Вносят 5,0 мл разбавленного иодного раствора в пробирки диаметром 13 мм и высотой 200 мм, которые помещают в водяную баню с температуройО30 С, Вводят 10 мл крахмала Линтнера в пробирку диаметром 23 мм и высотой 200 мм и помещают ее в водяную банюос температурой 30 С,25 мл разбавленного раствора А-амилазы вносят в пробирки 23 х х 200 мм и ставят их в водяную банюос температурой 30 С, 5 мл разбавленной пробы неизвестного фермента добавляют в 10 мл раствора крахмала и после добавления половины неизвестного раствора-амилазы пускают секундомер и затем вливают оставшуюся половину раствора из пипетки.В соответствующие интервалы времени в пробирку, в которой находится отрегулированный разбавленный иодный раствор, добавляют 1 мл гидролизующий смеси (крахмал, раствор -амилаэы),Встряхивают содержимое, выливают его в калиброванную квадратную трубку (13 мм) и сравнивают со стандартным окрашенным диском в компараторе Геллиже, 1 мл вносят в йодный раствор для того, чтобы можно было более точно определить точку кипения. При приблизительном достижении времени точки кипения пробы необходимо извлекать через интервалы времени, равные 0,1 мин (6-12 с).13 Составитель Е.ВоробьеваТехред А.Кравчук Корректор А.Зимокосов Редактор Н,Гунько Заказ 4840/59 Тираж 499 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул,Проектная, 4 Растворы, используемые при описанном анализе, получают следующим образом,Раствор крахмала, Растворимыйкрахмал Линтнера (10 г) смешивают с35 мл дистиллированной воды в колбе,которую затем нагревают до кипенияи выдерживают в течение 5 мин притемпературе кипения с постоянным перемешиванием. После этого раствор охлаждают до комнатной температуры идобавляют 125 мл ацетатного буферного раствора и достаточное количествоводы, доводят общий объем колбы до500 мл. Добавляют 1 мл толуола. Стабильность этого раствора проверяютс помощью стандартной пробы 1 -амилаэы известной концентрации,Ацетатный буферный раствор. Взвешивают 1 моль ацетата натрия(82,0 г) и растворяют его в 800 млводы, Доводят рН до 6,2+О, с помощьюуксусной кислоты и разбавляют содержимое дол, При приготовлении 1 лкрахмального субстрата требуется20 мл раствора,Разбавительный раствор хлористого кальция 0,025 М - растворяют11,1 г химически чистого безводногохлористого кальция в 4 л воды.Буферный раствор, Растворяют25,3 г гранул гидроокиси натрия и340 г первичного кислого фосфата калия в дистиллированной воде и доводят содержимое в мерной колбе до 2 л.При достижении буферным растворомкомнатной температуры доводят содержимое до объема (рН 6,2 + 0,1).Основной йодный растворРастворяют 5,50 г химически чистых кристаллов йода и 11,0 г К 1 в Н О и разбавляют содержимое до 250 мл, Хранятраствор в темной бутыли.Разбавленный йодный раствор, Растворяют 20,0 г К 1 в НО, добавляют 4424762,00 мл основного йодного раствораи разбавляют до 500 мл. 5С помощью описанной методики активность полученной (-амилазы превышает 1500 - 2000 ликфон/мл противкультуры В. 1 сЬепЫогпаэ, 125 ликфон/мл, полученных в ферментативной О среде для известного продуцента в товремя, как те же культуры демонстрируют даже более низкие активности, аименно ниже 50 ликфон/мл, в известнойсреде.15 Другим методом измерения активности .-амилаэы является видоизмененная БКВ технология. В этих единицах известные культуры продуцируютменее 500 ЯКВ единиц/мл, в то время 20 как активность Васд 11 цз 11 спепдГогтпдз АТСС 39326 10000 ЯКВ ед./мл,Формула и з о б р е т е н и я 1, Способ получения термически устойчивой бактериальной 1 - амилазы,предусматривающий культивированиепродуцента бактерий Вас 11 из 11 сЬепдГогшз в питательной среде, содержа 30 щей источники углерода, азота, минеральные компоненты и воду, в условиях аэрации и перемешивания с последующим выделением целевого продукта,отличающийся тем, что,Зб с целью повышения активности ,-амилазы, в качестве продуцента из видаВас 11 цз 1 сЬеп 1 йогппз используютштамм бактерий Вас 11 цз 11 сЬепд 2 огш 1.з АТСС 39326, а культивирование40 осуществляют в условиях рН среды5,5 - 8,0.2. Способ по п,1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что в качестве источника углерода в питательной среде ис 45 пользуют лактозу в концентрации 515 мас,7,