Способ приготовления посевного материала для культивирования плесневых грибов вида aspergillus аuтамоri, продуцирующих глюкоамилазу (его варианты)

Союз СоветскикСоциалистическихРеспублик ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(Я)М. Кл. С 12 й 1/14 С 12 Й 9/3" Гввударетееккьа квмлтет СССР. пе делам кзвбретенкк и вткрытий(23) П риоритет Опубликовано 15,01.83, Бвллетевь2 Дата опубликования описания 15.01.83(72) Авторы изобретени Всесоюзный научно-исследователброжения(71) Заявитель ПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛАЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ ВИДАЬРЕРС 1 ЫБ АЫАИОВ 1, ПРОДУЦИРУ 10 ЩИХГЛЮКОАМИЛАЗУ (ЕГО ВАРИАНТЫ) 5 2довые ростки и необходимые минераль.ные соли, выращивание продуцента до обильного спороношения и последующее культивирование на производственной питательной среде. В качестве источ ника углерода используют 10-30 кукурузной муки. Приготовленный посевной материал вводят в количестве 0,01-0,53 в производственную среду, содержащую, : мука 1, вытяжки иэсолодовых ростков 18, (Й 1 Ц )50, 0,6, ЯН 4 НРОд 0,6, КНР 0,1, Мд 50, 0,05Недостатком этого способа является низкая активность культуры, поскольку она не адаптирована к высоким концентрациям углеродаЦель изобретения - адаптация посевного материала к высококонцентрированным производственным углеродным средам, повышение активности посевного материала и сокращение его расхода. достигаетсяособу пригот Поставленная цеем, что согласно 1Изобретение относится к микробиологической промышленности, а имен- но к способам приготовления посевно- го материала для культивирования плесневых грибов вида Аьрегс 1111 пэ аиавог 1, продуцирующих глюкоаяилазу.Известны способы приготовления посевного материала для культивирования плесневых грибов вида Аэрегд 111 цэ аиавог 1, продуцирующих глюкоамилазу, включающие от одной до четырех стадий пересевов культуры при глубинных условиях культивирования с изменением концентрации среды по крахмалу с б до 20. Это способы вегетативного ведения культуры 1 1 1,Недостатками данных способов является получение культуры с низкой активностью.Наиболее близким к предлагаемому является конидиальный способ 21 предусматривающий посев продуцента на увлажненную питательную среду, содержащую источник углерода, соло, %агеенко йФ 1 Аделютак ский. ийститут,. п роду то3 98886ления посевного материала для культивирования плесневых грибов видаАзрегс 1111 цз аиапюг 1 продуцирующихглюкоамилазу, предусматривающему посев продуцента на увлажненную питательную среду, содержащую источникуглерода, солодовые ростки и необходимые минеральные соли, выращиваниепродуцента до обильного спороношения и последующее культивирование Она производственной питательнойсреде, в качестве источника углеродав твердых питательных средах используют 50-901 пшеничных отрубей и 40"903 муки: кукурузной или ячменной, дили рисовой, или ржаной, или маниоки,или соевой, а процесс выращиванияпродуцента ведут в две стадии приразличном температурном режиме, поддерживая его на первой стадии в течение 5-6 дней равным 29-310 С, а по до, стижении обильного спороношения температуру снижают до 20-2 ч С и осущесгвляют вторую стадию также в течение5-6 сут с последующей селекцией полученных на этой среде конидий в несколько пассажей, при этом в качестве производственной среды используют высококонцентрированное по углероду зерновое сусло с концентрацией15-25 Б.При этом при выращивании штаммаАзр. аиащог 1 66 селекцию ведут в двапассажа при повышении активности от100 ед ГлА/г сухой культуры настадии выращивания до 300 ед ГлА/г35сухой культуры после второго пассажа.Кроме того, увлажнение питательныхсред осуществляют раствором следующих солей, вес.4: МаИО 0,9-1;(НН 4) НРО 4 0,2-0 3 КНРО, 0,22-0,23КС 1 0,11-0,12; МО 50 д 0,103-010 Й;Ге 504 0,011-0 0151 Мп 504. 0,05-0,06;Со 504 0 ООЙ,005; Еп 504 0,0010002; Сц 50 0 ООЙ; вода " остальное,Способ приготовления посевного материала для культивирования плесневыхгрибов вида Азр. аиааог 1 продуцирующих глюкоамилазу, предусматривающийпосев продуцента на питательную сре"Юду, содержащую источник углерода,выращивание продуцента до обильногоспороношения и последующее культивирование на производственной питательной среде, посев продуцента осуществляют на среду, содержащую растворимый крахмал 2154 агар-агар 1-2 Ф,и ячменное сусло 7-84 а процесс вы 7 4ращивания ведут в две стадии при различном температурном режиме, поддерживая его на первой стадии в течение 5 о6 дней равным 29-31 С, а по достиженииобильного спороношения температуруснижают до 20-21 С и осуществляютвторую стадию в течение 5-6 сут, приэтом в качестве производственнойпитательной среды используют высококонцентрированное по углероду зерноовсе сусло с концентрацией 15-25 Б.Засев посевного материала в производственную питательную среду осуществляют в количестве 0,0012500053 к объему питательной среды.Предлагаемый способ осуществляютследующим образом,Готовят концентрированную по крахмалу твердую питательную среду, содержащую от 50 до 903 пшеничных отру.бей с соответствующей добавкой солодовых ростков или от ЙО до 90 маниоки, или ржаной, или ячменной илирисовой, или кукурузной или соевоймуки с соответствующей добавкой солодовых ростков. Увлажняют твердуюсреду до 60 влажности или просто водопроводной водой или раствооом солейследующего состава, вес,Ъ: йаИО 0,9,(МНд)НР 04, 0,2; КН РОд 0,22 КС 1 0,11М 950, 0,103; Ге 50, 0,011; Мп 50,0,005Со 504 0,00 ч; Еп 50 0,001; Сц 500001вода - остальное.Культуру выращивают 5-6 дней при29-31 С, а затем температуру снижают до 20-24 С и осуществляют вторуюстадию выращивания также 5-6 дней.После этого осуществляют селекциюкультуры на этой же среде при техже параметрах и времени. Получают1 и 1 пассажи культуры. Готовые пассажи засевают на зерновое сусло,содержащее 15-2,р Б. Посев продуцента можно осуществлять на среду, содержащую растворимый крахмал от 2до 153, агар-агар 1-2/ и ячменноесусло 7-84 а затем готовые пассажизасевают на зерновое сусло, содержащее 15-250 Б.Активность посевного материала сприменением концентрированных покрахмалу сред варьирует от 100 до210 ед/г сухой культуры, а количество спор от 2,2 до 12 млрд, конидий на 1 г сухой культуры; Причемнаблюдается корреляция активациикультур с увеличением дозировки крахмала и полное отсутствие корреляции в отношении спорообразования.8 ь 7 6сухой культуры, 220 ед/г сухой культуры 1 пассажа, 250 ед/г сухой куль"туры П пассажа. Затем готовую культуру засевают в количестве 70-90 тыс.конидий на 1 мл питательной средына 18 Бал кукурузное сусло, После7 сут культивирования активностьглюкоамилазы в культуральной жидкостисоставляет для 1 пассажа 350 ед/мл,П пассажа 410 ед/мл, Н пассажа550 ед/мл,П р и и е р 2. Питательную среду,состоящую из 503 кукурузной муки и503 солодовых ростков, приготовляют,выращивают и рассевают на пассажи1 и П так же, как в примере 1. Полученный конидиальный споровцй материал с активностью 250 ед/г сухой культуры засевают 60-80 тыс. конидий на1 мл питательной среды на 18 Бал ку"курузное сусло, После 7 сут культивирования получают кульгуральную;жидкость с активностью глюкоамилазы:пассажа 400 ед/мл, . Н пассажа600 ед/мл.П р и м е р 3. Приготовляют на косом агаре культуру Азр. ахааог 1 насреде, содержащей вес. 4: раствори- .мого крахмала 10, 8 Бал ячменное сусло, агар-агар 2. Культуру выращиваютпри тех же условиях температуры и времени, что и в примере 1. Затем полученную культуру засевают в количестве 90 тыс. конидий на 1 мл питательной среды на 20 Бал кукурузном сусле,После 7 сут культивирования активоность глюкоамилазы на 18 Бал кукурузном сусле состаавяет 350 ед/мл, на20 Бал кукурузном сусле - 400 ед/мл(для 23 концентрации растворимогокрахмала в среде) и 400 ед/мл для18 Бал кукурузного сусла 101 растворимого крахмала на косом агаре),Ф500 ед/мл для 20 Бал кукурузногосусла (104 растворимого крахмала накосом агаре).П р и м е р 4. Твердую питательнуюсреду того же Состава, что в примере1, увлажняют до 603 солевым раствором состава, вес.Ф: азотнокислый натрий (ИайО) 0,9; двузамещенный фос,форнокислый аммоний (ЙН)НРО 4 0,2,однозамещенный фосфорнокислый калийКНРО 0,22, хлористый калий КС 1О,И, сернокислый. магний М 950 0,103сернокислое железо закисное Ге 504.0,011 сернокислый марганец Мп 504..0,005, сернокислый кобальт Со 5040,004, сернокислый цинк Еп 50,1. 0,001 ЭО 5 988В связи с этим для увеличения спорообразования, а также активацииконидиального материала, с цельюуменьшения расхода культур, можнодобавлять растворы солей при увлажнении твердыХ питательных сред. Приготовленный посевной материал засевают в производственную среду в количестве 0,00125-0,005. Дозировкуполученного активированного конидиального посевного материала на высококонцентрированные среды необходимо проводить.с учетом конкурентной борьбы за субстрат (т.е. концентрации среды по углероду) и с учетом природы атакуемости субстрата(различные по крахмалу субстраты),например, для различных штаммов Азр.аюащог 1 в диапазоне от 25 до 100 тыс.конидий на 1 мл среды (18-20 О Бал ку . курузного сусла) и от 800 тыс, до1 млн, конидий на 1 мл среды (1820 Бал пшеничного, ячменного, рисо-.вого, соевого, ржаного сусла), Присоблюдении рекомендуемых условий 25выращивания и дозировки посевногоконидиального материала активностьглюкоамилазы в культуральной жидкости на 6-7 сут роста составляет 300350 ед/мл культуральной жидкостидля 1 пассажа 400-450 ед/мл культуральной жидкости, для второго пассажа 500-600 ед/мл культуральной жид" кости.П р и м е р 1, Питательную среду, состоящую из 503 пшеничных отрубей и, 50 солодовых ростков, увлажняют до 603 водопроводной водой, засевают культурой гриба Аьр. аиавог 1 466 Увыращенной на агаризованной среде сле-, дующего состава, 4: сахароза 2, азотнокислцй натрий (йаИО) 0,91, одно- замещенный,фосфорнокислый калий (КН РО) 0,1 магний сернокисльй (МЯЛО) 0,051 хлористый калий,(КС 1) 0,05; сернокислое железо (Ге 50) 0,001, агар-агар 2 (при 22 ОС в течение 14 дней).Засеянную культуру выращивают 6 дней при 30 фС в термостате, а затем выращивают при 20 С также 6 дней. После выращивания осуществляют селекцию культуры на этой же среде при тех же параметрах температуры и времени. И получают 1 и 11 пассажи культуры пере 55 севом выращенной культуры на 1 пассаж и 1 пассажа на П пассаж.Активность глюкоамилазы готовых посевных культур составляет 115 ед/г .9888сернокислая медь Сц 50 0,004, водаостальное, Получают конидиальный материал с активностью 150 ед ГлА/гсухой культуры. Затем его высевают вколичестве 78 тыс. конидий на 1 млпитательной среды 18 Бал кукурузного сусла, На 7 сут роста получаюткультуральную жидкость с активностью400 ед ГлА/мл культуральной жидкости,П р и м е р 5 Питательную сре- о.ду, состоящую из 703 ржаной муки,303 солодовых ростков, увлажняют до603 водопроводной водой, выращивают и рассевают на пассажи так же,как и в примере 1. Полученный посев.- 1 Бной материал с активностью 205 ед/гсухой культуры засевают. в количестве 850 тыс. конидий на 1 мл питательоной среды на 18 Бал кукурузное сусло. После 7 сут культивирования по- щлучают культуральную жидкость с активностью ГлА дляпассажа 300 ед/мл,- 350 ед/мл,- 400 ед/мл.П р и м е р 6. Питательную среду, состоящую из 70 ячменной муки 2и 30 солодовых ростков, увлажняюти рассевают так же, как в примере1. Полученный посевной материал сактивностью 200 ед/г сухой культурызасевают в количестве 900 тыс, кони- зодий на 1 мл питательной среды на кукурузное сусло 18 Бал. После 4 суткультивирования получают активностьглюкоамилазы (ГлА) для: 1 пассажа350 ед/мл, П - 400 ед/мл, Ш - 430 ед/млП р и м е р 7. Питательную среду,состоящую из 504 рисовой муки и 504солодовых ростков, приготовляют, выращивание и рассев производят также, как в примере 1. Полученный конидиальный материал с активностью210 ед/г сухой культуры засеваютв количестве 830 тыс. конидий на 1 млпитательной среды на 19 ОБал кукурузное сусло. После 7 сут культивирования получают культуральную жидкостьс активностью ГлА для:пассажа330 ед/мл, для- 400 ед/мл, дляШ - 500 ед/мл,П р и м е р 8. Питательную средусостоящую из 504 маниоки и 50 соло- Одовых ростков приготовляют, вырашивание и рассев производят так же, каки в примере 1 Полученный посевнойматериал с активностью ГлА 200 ед/гсухой культуры засевают в количестве 900 тыс. конидий на 1 мл питательной среды на 18 Бал кукурузное сусло. После 7 сут культивирования по 67 8лучают культуральную жидкость с активностью ГлА для 1 пассажа 320 ед/млдля П - 370 ед/мл, для Р - 450 ед/мл.П р и м е р 9. Питательную среду,состоящую из 50 пшеничных отрубейи 503 солодовых ростков, засеваютштаммом гриба Азр. аиавог 224-21и рассевают так же, как в примере 1.Полученный посевной материал с активностью 100 ед/г сухой культуры засевают в количестве 50 тыс, конидийна 1 мл питательной среды 18 Балкукурузное суслоПосле 7 сут культивирования получают культуральнуюжидкость с активностью ГлА для: 1,пассажа 80 ед/мл, для П - 150 ед/мл,для Ш - 200 ед/мл.Согласно изобретению, получаютспороносящую культуру от (2-4)109спор в 1 г воздушно-сухой культуры,но более активизированную, котораяпри дальнейшем культивировании в глубинных условиях на высококонцентри"рованных углеводных средах позволяет увеличить биосинтез глюкоамилазы. в 2-3 раза по сравнению с контролем(вегетативной культурой),Кроме того, упрощается технологическая схема подготовки посевногоматериала: исключается посев в маточники, обеспечивается микробиологическая стерильность процесса; сокращается на 1,5-2 сут время приготовленияпосевного материала, активность новых конидиальных культур при хранении при 20-25 ОС не уменьшается в течение 1-1,5 лет, а дляипассажей повышается по сравнению с контролем, т.е. хранением культуры накосом агаре уменьшается расход ко, нидиального посевного материала посравнению с принятым ранее в 100 раз,а по сравнению с вегетативным в200 раз.Формула изобретения1. Способ приготовления посевного материала для культивирования плесневых грибов вида Азрег 911 цз аиапог продуцирующих глюкоамилазу, предусматривающий посев продуцента на увлажненную питательную среду, содержащую источник углерода, солодовые ростки и необходимые минеральные соли, выращивание продуцента до обильного спороношения и последующее культивирование на производственСоставитель И,ПриваловаРедактор Е.Лазуренко ТехредТ.Фанта Корректор С.ШекмарЗаказ 99 и раж 521 одписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, 3-35, Раушская наб., д. 4/5 лиал П П атент , г, Ужгород, ул, роктная,9 9 .:ной питательной среде, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью повышения активности посевного материала ,путем адаптации его к высококонцентрированным производственным углеводным питательным средам и сокращения расхода посевного материала, в качестве источника. углерода в твердых питательных средах используют 50- 90 пшеничных отрубей и. 40-903 муки: кукурузной или ячменной, или рисовой, или ржаной, или маниоки, или соевой, а процесс выращивания продуцента ведут в две стадии при различном температурном режиме, поддержи- вая его на первой стадии в течение 5.-6 дней равным 29-31 ОС, а по дости.жении обильного спороношения температуру снижают до 20-24 С и осуществляют вторую стадию в течение 5-6 сут с последующей селекцией полученных на этой среде конидий в несколько пассажей, при этом в качестве производственной питательной среды используют высококонцентрированное по углероду зерновое сусло с концентрацией 15-25 Б. 2, Способпоп. 1, отлича- Ю щ и й с я тем, что при выращивании в качестве продуцента штамма Азрегд 111 нз аиаеог 1 466 селекцию ведут в два пассажа при повышении активности от 100 ед ГлА/г сухой куль. туры на стадии выращивания до 300 ед ГлА/г сухой культуры после второго пассажа,3, Способ по пп, 1 и 2, о т л и. ч а ю щ и й с. я тем, что увлажнение питательных сред осуществляют раствором следующих солей, вес.3: йайО 0,9-1 (ИН)НР 04 0,2-0,3 КНР 04 0,22-0,231 КС 1 0,11-0,121 Мд 504 0,103-0,104; Ге 50 д 0,011-0,015 Мл 50 ф 0,05-0,061 Со 50+ 0,004-0,005; 88867 102 п 50,. 0,001-0, 002; Си 504 О, 004"0,005, вода - остальное,Способ приготовления посевного материаладля культивированияплесневых грибов Азрегя 111 цз аиаао"г 1, продуцирующих глюкоамилазу., предусматривающий посев продуцента напитательную среду, содержащую источник углерода, выращивание проду-,1 ю цента до обильного спороношения ипоследующее культивирование на производственной питательной среде,о т л и ч а ющ и й с я тем, что,с целью активации посевного матери 1 ала путем адаптации его к высококонцентрированым по углероду питательным средам, посев продуцента осу.ществляют на питательную среду, содержащую 2-153 растворимого крахмао ла, 1-2 Ф агар-агара и 7-83 ячменного сусла, а процесс выращивания ведут в две стадии при различном тем.пературном режиме, поддерживая его,на первой стадии в течение 5-6 днейравным 29"31 С, а по достижении обиль.ного спороношения температуру снижают до 20-24 С и осуществляют вторуюстадию в течение 5-6 сут, при этомв качестве производственной питатель.ной среды используют высококонцентри.рованное по углероду зерновое суслос концентрацией 15-25 Б.5. Способ по пп, 1-4, о т л ич а ю щ и й с я тем, что засев посевного материала в производствен 35ную питательную среду осуществляютв количестве 0,00125-0,005 к объемупитательной среды.Источники информации,принятые .во внимание при экспертизе1. Грачева И.М, Технология фер"ментных препаратов. М., 1979, с. 67 69.,2. Авторское свидетельство СССРИ 668941, кл. С 12 М 9/34, 1977